柴胡與醋柴胡抗大鼠免疫損傷性肝纖維化作用比較研究

汪 巍， 王麗娜， 許 枬， 賈天柱

(遼寧中醫藥大學藥學院， 遼寧 大連 116600)

柴胡為我國傳統中藥，始載于《神農本草經》，列為上品，稱之為地熏、茈胡。《本草綱目》稱柴胡是“引清氣退熱必用之藥”。 現代對柴胡的化學成分及藥理作用做了大量深入的研究，表明柴胡的化學成分主要有皂苷、黃酮、揮發油、多糖、脂肪酸、甾醇、氨基酸及微量元素等成分，具有解熱、鎮靜、抗炎、抗病毒、抗細菌內毒素、降血脂、保肝利膽、促進酶分泌、抗腫瘤、調節免疫、抗驚厥等藥理作用。

柴胡傳統炮制方法有多種，主要的有清炒、醋制、鱉血制、酒制和蜜制五種。現行《中國藥典》中僅收載南、北柴胡及其醋炙品。清代《本經逢原》柴胡項下提出“入解表藥生用，清肝炒熟用”。現在臨床應用也認為生柴胡的升散作用較強，多用于解表退熱；醋柴胡可以緩和升散及解表退熱作用，并可增強疏肝止痛作用，多用于肝郁氣滯的脅痛、腹痛及月經不調等癥。柴胡醋制前后保肝作用是否存在差異？故課題組針對柴胡醋制前后的保肝作用進行比較研究，本實驗針對柴胡醋制前后抗肝纖維化作用進行考察。選用豬血清致大鼠免疫損傷性肝纖維化模型，通過ELISA法測定大鼠血清中PCⅢ、ColⅣ、HA、LN、FN的水平，結合肝組織切片及HE化學染色觀察，比較柴胡醋制前后抗肝纖維化作用差異。

1 材料和方法

1.1 飲片來源 柴胡飲片購于遼寧正大祥和藥業集團有限公司，批號201105245，產地遼寧。

1.2 醋柴胡飲片的制備 生柴胡加入定量米醋(每100 kg用米醋20 kg)拌勻，稍燜潤，待醋被吸盡后，置炒制容器內，用文火加熱，炒干，取出晾冷。

1.3 柴胡水煎液的制備 分別將生柴胡和醋柴胡用水煎煮制成1∶2水煎劑(相當于生藥)，備用。

1.4 試劑 豬血清(北京雅安達生物技術有限公司，批號120418)；聯苯雙酯滴丸(浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，批號H33020232)；大鼠Ⅲ型前膠原(PC Ⅲ)、大鼠Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)、大鼠黏連蛋白(LN)、大鼠透明質酸(HA)、大鼠纖維連接蛋白(FN)酶聯免疫分析試劑盒均購于上海科興商貿有限公司，批號201211。

1.5 儀器 離心機(上海安亭科學儀器廠，型號,TGL-16C);酶標儀(Thermo上海儀器有限公司，型號，MULTISKAN MK3)；石蠟切片機(德國萊卡公司)；奧林巴斯BX51顯微鏡。

1.6 動物及分組 雄性SD大鼠，體質量130～150 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供許可證號SCXK(遼)2008-0002，清潔級(CL)。大鼠常規喂養1周后，按體質量隨機分為5組，每組10只，分別為生柴胡組、醋柴胡組、空白對照組、模型對照組、聯苯雙酯陽性對照組。

1.7 實驗方法

1.7.1 造模及給藥 選用豬血清誘導免疫損傷性肝纖維化模型，參照文獻[1]方法進行造模。大鼠稱質量后各組動物以10 mL/kg劑量灌胃給藥，空白組和模型組給同體積生理鹽水，陽性藥組灌胃聯苯雙酯0.15 g/kg。給藥同時每只大鼠腹腔注射血清0.5 mL，每周2次，連續8周。實驗結束采集樣本前，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第8周末，末次給藥后處死大鼠，取血清進行各項指標檢測，取肝臟組織做組織切片。

1.7.2 肝纖維化指標檢測 大鼠眼內眥取血，3 000 r/min離心5 min,取血清，ELISA法檢測PC Ⅲ、Col Ⅳ、LN、 FN、HA水平。

1.7.3 肝臟病理組織學檢查 脫頸椎處死大鼠，取大鼠肝臟組織，切取同一葉同一部位小塊肝組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規制片與HE染色，普通光鏡下觀察病理組織學變化。

2 實驗結果

2.1 柴胡及其醋制品對肝纖維化大鼠各項血清指標的影響與正常組大鼠比較，模型組大鼠血清PCⅢ、ColⅣ、HA、LN、FN明顯升高，與模型組比較，聯苯雙酯陽性組，生、醋柴胡組大鼠各血清指標均有下降，醋柴胡與陽性藥組呈顯著下降。結果見表1、表2。

表1 生、醋柴胡對PCⅢ、ColⅣ的影響

表2 生、醋柴胡對HA、LN、FN的影響

2.2 柴胡及醋制品對肝纖維化大鼠肝臟病理組織學的影響 正常組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞大小正常，肝細胞索排列有序、肝血竇腔隙規則，無纖維組織增生，肝細胞無變性、壞死及炎性細胞浸潤。模型組大鼠顯微鏡下可見肝小葉間大量纖維組織增生，中央靜脈不規則，與匯管區交織成網，形成纖維間隔，肝細胞大面積變性、壞死，肝細胞索排列紊亂，可見大小不等脂肪細胞，細胞間質可見大量的炎性細胞浸潤。陽性藥組大鼠肝小葉組織形態、結構與模型組比較有明顯的好轉，小葉間增生的纖維組織明顯變薄及消失，脂肪細胞、炎性細胞減少，壞死的肝細胞也有所改善。生柴胡組與模型組比較，肝小葉組織形態、結構有所改善，仍可見肝小葉間粗細不勻、增生的纖維組織形成纖維間隔，少量的炎性細胞浸潤及散在的脂肪細胞，肝細胞壞死有所好轉。醋柴胡組與模型組比較，肝小葉組織形態、結構恢復較好，肝小葉間纖維組織增生基本消失，肝細胞大小基本正常， 偶爾可見間質有散在的炎性細胞及脂肪細胞， 肝細胞索排列較好。

3 討論

肝纖維化是由過多的細胞外基質(ECM)在肝內沉積所導致的，伴隨著肝纖維化的進程,ECM的量和成分也會發生變化。而ECM的主要成分是膠原，主要是Ⅰ、 Ⅲ和Ⅳ型膠原，尤其是Ⅰ和Ⅲ型是肝纖維間隔的重要來源。ECM的其他成分還包括有粗纖維調節素、纖維連接蛋白(FN)、彈性蛋白、層黏連蛋白(LN)、透明質酸(HA)和蛋白多糖[2]。本實驗結果顯示醋柴胡組和陽性藥組能夠明顯降低豬血清所導致的免疫損傷性肝纖維化大鼠Ⅳ型膠原酶、Ⅲ型前膠原酶、層黏連蛋白(LN)酶、透明質酸(HA)酶、纖維連接蛋白(FN)水平，降低肝組織纖維化程度。提示醋柴胡對免疫損傷性肝纖維化大鼠細胞外基質的合成和沉積起到抑制作用，從而起到降低肝纖維化程度，恢復肝臟功能的作用。

柴胡皂苷為柴胡主要有效成分之一，藥理活性較強。已經明確，柴胡皂苷具有解熱、鎮靜、明顯的中樞抑制、抗炎、特異性阻礙膽堿酯酶、免疫調節、抗病毒、抗肝纖維化、抗腫瘤、止痛、抗菌、保肝、抗腎炎、利尿等作用[3-5]。豬血清誘導大鼠免疫損傷性肝纖維化的原理主要是豬血清能夠刺激大鼠產生抗豬血清的抗體，形成免疫化合物沉積于肝竇和血管壁上，激活補體，引起炎癥細胞浸潤，釋放炎癥介質，造成肝細胞損傷、壞死，形成纖維化。而有研究[6]認為柴胡皂苷正是通過其自身抗炎和免疫調節的生物特性，實現其對肝纖維化機制的干預，首先通過抗炎作用減少細胞炎性介質的釋放，阻止其啟動和加劇肝纖維化過程；其次抑制肝星狀細胞激活，調節細胞因子，平衡免疫系統，阻止因細胞因子瀑布效應導致ECM過度沉積，從而起到抗肝纖維化的關鍵作用。從而證明柴胡皂苷是柴胡抗肝纖維化的物質基礎之一。另有實驗研究[7]證實:柴胡總皂苷可以改善四氯化碳所致的大鼠肝纖維化，并且具有一定的量效關系。且有研究[8-9]表明生藥加工成飲片后，總皂苷量降低，而經醋制后較生品有所升高。表明醋制后柴胡總皂苷的溶出率有所提高。有研究證明柴胡皂苷只有苷元才具有藥理作用。而在柴胡中只有部分皂苷以苷元形式存在，在醋制的過程中，米醋提供了酸性的條件，炒制的過程又提供了高溫，這有助于柴胡皂苷水解成苷元和糖類，從而增強部分藥理作用。這也進一步說明了柴胡醋制后抗肝纖維化的作用優于生柴胡的原因。

參考文獻：

[1] 張均田.現代藥理實驗方法[M].北京:北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社,1998:1062-1064.

[2] 扈 榮，傅旭春，沈麗美，等. 百令疏肝膠囊治療免疫損傷性肝纖維化的實驗研究[J].浙江大學學報,2012,39(5):571-575.

[3] 史 青，聶淑琴，黃璐琦，等.柴胡屬植物化學成分及藥理研究新進展[J]．中國實驗方劑學雜志，2002，8(5)：53-56．

[4] 口維敏．炮制對柴胡藥效的影響及臨床運用規律[J]．時珍國醫國藥，2006，17(10)：1998-1999．

[5] 姜 華，李 軍，石任兵，等．炮制對柴胡藥材中4種柴胡皂苷的影響[J]．中國藥學雜志,2009，57(21)：618-621．

[6] 朱蘭香，劉世增，顧振綸.柴胡皂苷的藥理作用及抗肝纖維化的應用[J].中草藥，2002,33(10)：5-6.

[7] 韓 玲. 柴胡總皂苷預防大鼠肝纖維化效果的觀察[J].江西中醫學院學報，2008,20(6):70-71.

[8] 王金權，王 娟，樊 敏，等. 炮制對柴胡質量的影響[J].中醫研究，2011，24(5)：43-46.

[9] 范秦鶴，王俊芳，陳全平． 柴胡及其炮制品有效成分比較[J]．中成藥，1994，16(2)：56.