荷葉不同飲片黃酮和生物堿類成分對(duì)兔體外凝血功能影響的比較

劉 洋， 張學(xué)蘭， 李慧芬， 隋曉輝， 占方玲

(山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟(jì)南 250355)

荷葉為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉，具有清暑化濕、升發(fā)清陽(yáng)、涼血止血的功效，荷葉炭收澀化瘀止血[1]。現(xiàn)代研究表明，荷葉生物堿和黃酮類成分為其主要活性成分。荷葉總生物堿具有降血脂、減肥、抑菌等作用[2-4]。荷葉總黃酮具有降血脂和保護(hù)心肌缺血作用[2,5]。荷葉黃酮類化合物主要為金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、槲皮素等[6]，荷葉生物堿類成分主要有荷葉堿、原荷葉堿、蓮堿等[7]。前期研究表明，荷葉炭可明顯縮短正常大鼠血漿活化部分凝血活酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間，增加大鼠血漿纖維蛋白原水平，其止血作用明顯強(qiáng)于生荷葉[8]；荷葉制炭后，荷葉堿、總生物堿損失殆盡，金絲桃苷、異槲皮苷量顯著降低，而槲皮素量升高6倍多[9-10]。但荷葉飲片止血的物質(zhì)基礎(chǔ)及荷葉制炭止血的機(jī)理目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究荷葉生、炭飲片總黃酮、總生物堿及金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、荷葉堿對(duì)兔體外凝血功能的影響，旨在發(fā)現(xiàn)荷葉飲片止血的活性物質(zhì)，探討荷葉制炭止血的炮制機(jī)理，并為制定荷葉飲片的炮制工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康新西蘭大耳白兔，體質(zhì)量2.2～2.5 kg，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(許可證號(hào)：scxk魯20080002)。

1.2 儀器 FA1604N型電子天平(精密度為十萬(wàn)分之一，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；PM PLUS型紅外測(cè)溫儀(美國(guó)Raytek公司)；多星電炒鍋(淄博多星電器集團(tuán)有限責(zé)任公司)；AYW8000型半自動(dòng)凝血分析儀(南京瑞麥科技開發(fā)有限公司)；LDZ4-0.8型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.3 藥物 荷葉購(gòu)自山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周鳳琴教授鑒定為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉經(jīng)加工而成的絲狀片。荷葉炭：取凈荷葉絲30 g，置電炒鍋內(nèi)，270 ℃(鍋底溫度)炒制10 min，取出，放涼。成品形如荷葉，表面棕褐色或黑褐色，得率為73.8%。

荷葉堿對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111566-200402，純度大于98%)；槲皮素、金絲桃苷、異槲皮苷(本課題組自制，純度均大于98%)；枸櫞酸鈉(天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110407)；凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒(PT，批號(hào)20110915)、活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定試劑盒(APTT，批號(hào)20110915)、血漿纖維蛋白原測(cè)定試劑盒(FIB，批號(hào)20110915)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 荷葉生、炭飲片總黃酮的制備 稱取荷葉炭粗粉135 g、生荷葉粗粉183 g(按得率計(jì)算，相當(dāng)于炒荷葉炭135 g)，分別用10、8倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓回收乙醇得浸膏。取浸膏加水超聲使其充分混懸，離心，取上清液通過(guò)D-101型大孔吸附樹脂，先用水洗至無(wú)色，再用50%乙醇洗至流出液無(wú)鹽酸鎂粉反應(yīng)，收集50%乙醇液，于水浴濃縮至干，取殘?jiān)瑴p壓干燥，制備成荷葉生品、炭飲片總黃酮。

2.2 荷葉生、炭飲片總生物堿部位的制備 稱取荷葉炭粗粉135 g、荷葉片粗粉183 g(按得率計(jì)算，相當(dāng)于炒荷葉炭135 g)，分別用15倍量含0.1%HCl的70%醇浸泡提取3次，每次36 h。合并3次酸醇冷浸提取液，以40%NaOH溶液調(diào)pH 9～10。提取液50 ℃減壓回收乙醇，得浸膏；干浸膏加少量水溶解，用硅藻土拌樣，研細(xì)，室溫晾干。以10倍量乙酸乙酯索氏提取3 h，減壓回收乙酸乙酯；濃縮液用2倍體積的pH1的HCl溶液萃取2次；合并HCl溶液萃取液，以40%NaOH溶液調(diào)pH11；再以相同體積的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，減壓濃縮，加入40%NaOH溶液堿析，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，過(guò)濾，真空干燥，所得白色粉末即荷葉生、炭飲片總生物堿。

2.3 供試品溶液的制備 稱取荷葉生、炭飲片總黃酮、總生物堿適量，分別加適量80%乙醇超聲溶解，得相當(dāng)于生藥濃度0.2 g/mL的溶液，再分別配制成每1 mL相當(dāng)于0.2、0.02、0.002 g生藥的供試液。稱取金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、荷葉堿適量，分別加適量80%乙醇超聲溶解，分別配成濃度為3、30、300 μmoL/L的供試液。

2.5 結(jié)果

2.5.1 荷葉不同飲片總黃酮和總生物堿對(duì)兔體外凝血功能的影響 結(jié)果表明，生荷葉總黃酮組高、中劑量可明顯縮短PT(P<0.01或P<0.05)、APTT(P<0.01)，低劑量對(duì)PT沒(méi)影響，可明顯縮短APTT(P<0.05)；荷葉炭總黃酮組各劑量均可縮短PT、APTT(P<0.01或P<0.05)，且荷葉炭總黃酮高劑量組與高劑量生荷葉總黃酮組比較，PT、APTT也顯著縮短(P<0.05)，中劑量組對(duì)PT的影響也要高于同質(zhì)量濃度生荷葉總黃酮組(P<0.05)；生荷葉總生物堿組高、中劑量可明顯增長(zhǎng)PT(P<0.01或P<0.05)，低劑量對(duì)PT沒(méi)影響，高劑量可明顯增長(zhǎng)APTT(P<0.01)，中、低劑量對(duì)APTT無(wú)影響；荷葉炭總生物堿各劑量組對(duì)PT、APTT均無(wú)明顯作用；荷葉生、炭飲片總黃酮和總生物堿各劑量組對(duì)FIB含量均無(wú)明顯影響。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 荷葉不同炮制品提取物及主要部位對(duì)PT、APTT、FIB的影響

2.5.2 荷葉4種化合物對(duì)兔體外凝血功能的影響 研究顯示，金絲桃苷組高、中劑量可明顯縮短PT(P<0.01或P<0.05)、APTT(P<0.01或P<0.05)，低劑量對(duì)PT、APTT無(wú)明顯影響；異槲皮苷組同上；荷葉堿組高、中劑量可明顯增長(zhǎng)PT(P<0.01)、APTT(P<0.01或P<0.05)，低劑量對(duì)PT、APTT無(wú)明顯影響；槲皮素組各劑量均可明顯縮短PT、APTT(P<0.01或P<0.05)，且與同質(zhì)量濃度的金絲桃苷組與異槲皮苷組比較，PT、APTT也顯著縮短(P<0.01或P<0.05)；但各組對(duì)FIB水平均無(wú)明顯影響。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 荷葉4種化合物各單體對(duì)PT、APTT、FIB的影響

3 小結(jié)與討論

3.1 體外凝血實(shí)驗(yàn)表明，荷葉生、炭飲片總黃酮及金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素均可顯著縮短兔血漿PT和APTT，具有較好的凝血活性；荷葉炭總黃酮的凝血作用強(qiáng)于生荷葉總黃酮，槲皮素的凝血作用強(qiáng)于金絲桃苷和異槲皮苷；荷葉堿、生荷葉總生物堿均可明顯延長(zhǎng)兔血漿APTT和PT，具有抗凝血作用。上述研究說(shuō)明，黃酮類成分為荷葉生、炭飲片止血活性物質(zhì)，荷葉堿、生荷葉總生物堿為荷葉抗凝血成分。

3.2 金絲桃苷(槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷)和異槲皮苷(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)的苷元均為槲皮素。為了探討荷葉金絲桃苷和異槲皮苷在炒炭過(guò)程中的轉(zhuǎn)化機(jī)制，取金絲桃苷、異槲皮苷對(duì)照品，分別置坩堝中，于烘箱中 270 ℃烘制3 min，制備各單體成分模擬炮制品。以槲皮素對(duì)照品為對(duì)照，采用HPLC對(duì)各單體成分模擬炮制品進(jìn)行分析，結(jié)果在金絲桃苷、異槲皮苷的模擬炮制品中均檢出槲皮素。說(shuō)明在荷葉制炭過(guò)程中，金絲桃苷、異槲皮苷受熱分解生成其苷元槲皮素。

3.3 甲基蓮心堿可阻滯鈣離子通道、抗血小板聚集和抗血栓形成[11]，蓮心堿具有抗血小板聚集和抗凝血作用[12]。荷葉生、炭飲片總生物堿的高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜分析表明， 荷葉炭品中蓮心堿、N-甲基異衡州烏藥堿、杏黃罌粟堿、 衡州烏藥堿及2-羥基-1-甲氧基阿樸啡的含量顯著低于生荷葉, 而荷葉中荷葉堿、N-降荷葉堿、番荔枝堿、甲基蓮心堿制炭后消失[13]。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)分析認(rèn)為，荷葉制炭后止血作用增強(qiáng)的主要原因是：(1)抗凝血成分荷葉堿、甲基蓮心堿、蓮心堿等生物堿量顯著降低；(2)具有止血作用的金絲桃苷、異槲皮苷轉(zhuǎn)化為止血作用更強(qiáng)的槲皮素。本研究為制定荷葉飲片的炮制工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，亦提供了專屬性科學(xué)依據(jù)。

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