結核病兔模型的建立應用及其研究現狀

柯常江，馮起校，李富浩

(中山市陳星海醫院廣東醫學院附屬中山醫院呼吸內科，廣東中山 528415)

·綜述·

結核病兔模型的建立應用及其研究現狀

柯常江，馮起校，李富浩

(中山市陳星海醫院廣東醫學院附屬中山醫院呼吸內科，廣東中山 528415)

結核病的發病人數之多、流行范圍之廣、致死率之高，是當今世界傳染病預防治療的難題之一。復制出人類結核病的動物模型已經成為研究結核病的重要工具。為了解結核病兔模型研究概況，本文對結核病兔模型動物品種品系的選擇、造模方法、應用范圍等做一簡要分析。

感染；動物模型；結核病；綜述

根據世界衛生組織流行病學調查表明，世界上約三分之一的人口曾不同程度感染上結核分枝桿菌，其中百分之十左右發展成為結核病，全球感染患者人數每年超過800萬，其中死于結核病約300萬人左右；結核病已成為當今世界由一種病原菌引起的疾病當中死亡患者最多的傳染病之一，我國約有超過100萬結核病患者，位居世界第二位，是全球結核病高發病率的國家之一[1]。因此，建立一個合理的動物模型對于深入研究結核病病因、機制、病理過程、機體免疫反應、診斷、藥物治療及新疫苗開發等具有重要的意義。本文對結核病兔模型動物品種品系選擇、感染途徑、感染方法、感染劑量、菌株毒力及其應用范圍做一簡要概述。

1 實驗兔的品種及品系的選擇

選擇實驗動物模型兔子品種及品系在實驗研究當中非常重要。目前我國常用的品種主要有中國白兔、青紫蘭兔、日本大耳白兔、新西蘭白兔等，其中新西蘭白兔最為常用。2004年Dorman等[2]發現通過氣溶膠途徑用H37Rv或Erdman株結核桿菌分別對新西蘭白兔遠交系和近交系進行感染并比較。感染后第5周，近交系兔子比遠交系兔子出現更大的肺結核病灶。用人型結核分枝桿菌H37Rv菌株感染后，近交系兔子比遠交系兔子出現更多的肺結核病灶并且每個病灶當中結核分枝桿菌的集落形成單位也明顯較多。比較二者的組織學，近交系兔子出現更多的干酪樣壞死及活菌數量，但上皮細胞卻極少。因此，表明近交系兔子比遠交系兔子對結核分枝桿菌更加敏感。在2005年Gupta等[3]利用該模型比較近交兔子與遠交兔子對結核分枝桿菌的敏感性和抗性發現兩者存在較大的不同：遠交兔子對結核分枝桿菌的敏感性和抗性存在明顯的個體差異，而近交兔子難以獲得。

2 常見結核病兔模型

2.1 肺結核兔模型1996年，Converse等[4]成功制作出空洞型肺結核兔模型，第一次描述并分析了肺結核空洞形成的完整過程。利用兩個不同劑量組的牛型結核分枝桿菌菌株通過氣溶膠途徑感染新西蘭白兔，分別吸入220～880個分枝桿菌單位和吸入3 900～5 800個分枝桿菌單位，兩組均可以發展成為結核典型病灶，如液化壞死和肺結核空洞。肺結核空洞最早出現在感染后第6周，在第33周肺部病變仍有液化及干酪壞死，其外周有大量纖維包裹。筆者還發現組織蛋白酶D在干酪樣壞死、液化及空洞形成的過程中起著重要的作用。2009年，Nedeltchev等[5]使用103～104CFU/0.3 ml劑量的結核分枝桿菌CDC1551、牛分枝桿菌AF2122、BCG和結核分枝桿菌H37Rv通過支氣管鏡接種于致敏的新西蘭白兔右肺基底段。感染后6～15周均可以產生明顯的結核空洞。牛分枝桿菌AF2122感染兔子的肺空洞液化組織可培養出桿菌數最高在106～109CFU，而其他三組介于104～108CFU之間。所有的動物都可發生肺部結核結節樣病變，但牛分枝桿菌AF2122感染引起的結核結節樣病理改變及肺外播散最為明顯。這種獨特空洞模型為結核空洞的發病機制及肺外播散研究提供了基礎。2011年，Subbian等[6]使用結核分枝桿菌HN878菌珠通過氣溶膠途徑感染新西蘭白兔，動物肺部出現一系列結核病理過程，如干酪樣壞死、液化及肺部組織能培養出結核桿菌，從而成功制作出肺結核模型，通過此模型用于研究磷酸二酯酶-4抑制劑CC-3052聯合異煙肼可以提高肺結核的治療效果。

2.2 結核病潛伏期兔模型Manabe等[7-8]使用104～106CFU劑量人型結核分枝桿菌H37Rv標準菌株通過氣溶膠途徑感染新西蘭白兔，感染后第5周所有兔子肺部組織的帶菌量可達到峰值，右上肺葉勻漿培養結核分枝桿菌量可達到2.07×103～2.8×104CFU，而且第36周1/3的兔子體內仍有至少1個帶活菌的干酪樣肉芽腫。若感染后第5周進行糖皮質激素免疫抑制，通過觀察發現結核菌素實驗反應、肺部干酪樣結節及結核桿菌數量增加、CD4+及CD8+T細胞減少，這樣可使結核分枝桿菌被重新激活，其中發展成為免疫重建炎癥綜合征兔模型的比例高達50%。此模型屬于結核病潛伏期模型，可用于研究免疫發病機制及提高疾病各階段的診斷將具有重要作用。Subbian等[9-10]通過氣溶膠途徑將(1.08±0.31)×103CFU結核分枝桿菌CDC1551感染新西蘭白兔，在感染后第4周感染兔子的肺勻漿培養結核分枝桿菌量達到峰值(3.0±1.3)×105CFU，以后持續下降至第24周時肺勻漿培養全為陰性。如果使用糖皮質激素可以誘導結核復發，肺勻漿培養結核分枝桿菌再次出現陽性并持續升高一段時間。這表明肺部組織內仍有極少部分結核分枝桿菌呈現出潛伏狀態，當免疫力抑制時可以重新激活。這種自發潛伏性結核病模型為結核病分子免疫機制研究奠定了基礎。

2.3 結核分枝桿菌所致家兔皮膚液化病理模型Zhang等[11]在新西蘭白兔皮內分別注射5× 102CFU/ml、5×104CFU/ml、5×106CFU/ml恥垢分枝桿菌菌液、H37Ra和BCG，第6周在病灶周圍第二次皮內注射相同劑量，第8周在明顯病灶處做病理組織檢查，最明顯的膿腫液化、壞死、破潰等病理改變出現在5×106CFU/ml劑量組。BCG引起結核病變最為嚴重，病變最輕的是恥垢分枝桿菌。典型的結核性肉芽腫可以在顯微鏡下觀察到。在結核病灶處的細菌抗酸染色當中所有動物兔子檢測結果都呈陽性。再次免疫后中、低劑量組的BCG不引起液化壞死潰瘍，但可以出現較輕的炎癥反應和較小結核結節，其余低、中劑量組未見到明顯結核病理改變。結核分枝桿菌皮內注射家兔皮膚模型，可用于結核性肉芽形成、繼而發生液化壞死、藥物篩選和新疫苗開發等方面的研究。此模型操作簡單、快速、直觀、成本較低，還有利于家兔使用范圍的推廣。

2.4 骨關節結核兔模型劉正文等[12]先將明膠海綿吸附結核分枝桿菌H37Rv菌株懸液(0.5 mg/0.1 ml)，再將其填充在無致敏新西蘭白兔L5上方的椎間盤處鉆骨孔內。結核菌感染后發現，兔子全身反應較輕，局部反應較明顯。感染組12只兔子中9只順利完成實驗，3只出現納差和消瘦；術后1個月有2只兔子出現X線陽性，術后2個月有4只兔子X線陽性，術后2個月有7只兔子MRI陽性，術后2個月6只兔子CT陽性。對感染組陽性兔子的椎旁軟組織及椎體做病理切片可以觀察到有類上皮樣細胞、膿細胞及壞死病灶等形成，感染組陽性兔子病灶明顯處取膿液做細菌培養顯示60.0%結核分枝桿菌生長。根據術后2個月6只兔子CT陽性推算出建立此模型有66.7%的成功率。因此，將合適劑量和濃度的結核分枝桿菌H37Rv菌株種植在未致敏的新西蘭白兔脊柱椎體局部，制作出兔脊柱結核動物模型的病理變化與人類脊柱結核非常相似。此模型盡管手術建立的脊柱結核動物模型，在發病機制上與人類脊柱結核尚有一定差異，但仍為目前較為可行的應用于脊柱結核相關研究的實驗載體。對于早期診斷脊柱結核有些學者利用脊柱結核動物模型進行分析磁共振彌散加權成像(DWI)及測量AD值可以獲得一定信息[13]。李萬里等[14]使用l×107CFU/ml H37Rv結核桿菌懸液0.2 ml對新西蘭白兔膝關節囊進行注射感染。第4周發現，家兔膝關節逐漸腫脹；X線攝片檢查顯示膝關節囊有腫脹；磁共振檢查顯示關節周圍軟組織腫脹，關節腔積液；病理檢查可見結核病灶；滑膜組織培養有結核桿菌生長；說明已成功制作出新西蘭白兔膝關節滑膜結核模型。此種模型構建的方法簡單，成功率高，重復性強，組內病變程度較一致，為膝關節結核的病理學及藥效學的動物實驗研究奠定了一定基礎。2002年，吳啟秋等[15]在家兔膝關節腔注入0.5 mg/0.1 ml牛型分支桿菌，成功建立兔膝關節結核模型。畢龍等[16]在實驗前對大耳白兔進行結核菌素純化蛋白(PPD)試驗陰性作為模型動物，再皮內注射1 ml BCG使動物致敏，然后對已經在動物股骨內髁松質骨內造好的隧道內注射大劑量結核因子(包括完全佛氏佐劑0.5 ml、皮內注射用卡介苗0.5 ml、300 μg/ml Mt Sonicate 0.5 ml)，由此引起遲發型超敏反應(DTH)及骨質破壞，可以從動物大體變化、病理組織學、放射學(X線片)來觀察免疫性骨結核模型的變化。可以明顯的觀察到，結核因子注射部位出現骨髓腔內的破骨細胞增殖、骨吸收破壞、大量單核巨噬細胞浸潤及干酪樣壞死。因此根據骨關節結核發病過程成功的制作出兔免疫性骨結核模型。此模型能替代活結核桿菌建立的動物模型并且可以模擬骨結核的病理特點。本模型構建的方法簡單，重復性強，成功率高。

2.5 結核性腦膜炎兔模型2007年Tsenova等[17]利用新西蘭白兔成功的制作出結核性腦膜炎模型。方法：在動物麻醉后，通過脊髓穿刺針進入小腦延髓池注入5×105CFU結核分枝桿菌H37Rv或HN878，通過腦脊液檢測培養出結核分枝桿菌、中樞神經系統體征及大腦組織病理學觀察都出現結核樣改變，通過此模型來研究BCG對結核分枝桿菌H37Rv及HN878免疫保護效能評估。結果發現，BCG對H37Rv及HN878感染都有免疫保護力，但對H37Rv感染免疫保護力最強。雖然BCG具有免疫保護力，但卻不能阻止兔子體重減輕，也不能阻止大腦和肺臟病變及癥狀的出現，同時也阻止不了結核桿菌向肝臟、脾臟、腎臟擴散。因此研究者建議，當運用動物模型來檢驗新疫苗的保護力時，不僅要用H37Rv標準菌株，同時還要用不同臨床分離菌株比如北京株。他們利用此模型，進行評估重組融合聚Mtb72F加AS02A、BCG(卡介苗)及重組融合聚Mtb72F加AS01B三者之間的免疫保護作用。最后得出結論：免疫力保護功效程度依次為重組融合聚Mtb72F加AS01B增強于重組融合聚Mtb72F加AS02A，后者又強于BCG[18]。因此，可以用于結核疫苗方面的研究。同時他們還利用結核性腦膜炎兔模型，表明了結核分枝桿菌H37Rv與結核分枝桿菌HN878和W4（W北京基因型）相比菌株毒力較弱[19]。

2.6 其他類型及應用Jassal等[20]通過支氣管鏡途徑將103～104CFU牛分枝桿菌分別感染致敏和末致敏的新西蘭白兔，對照觀察兔子體重、結核菌素試驗、肺部CFU數、肺部及肝脾腎的病理變化（如結核結節的數量）等，進一步對評價結核性兔模型大體病理評分系統(Gross scoring system)制定與完善。楊奇等[21]實驗動物選用日本大耳白兔，一組經動物耳靜脈直接注射107/1 ml H37Rv菌懸液，一組動物免疫器官功能被鈷-60輻射破壞后耳靜脈注射H37Rv菌懸液(107/ml)。3周后處死動物，內臟器官做病理組織切片經BCG免疫組織化學染色、MCT(三色)染色、HE染色、Z-N染色及電鏡觀察。結果顯示，動物心肌和冠狀動脈均可以觀察明顯結核病變，而且免疫功能低下動物易于感染結核并較為嚴重。本實驗以家兔作為動物模型來探討結核桿菌能否導致冠狀動脈的病理性損傷。

3 結語

肺結核兔模型為結核空洞的發病機制、病理形成過程、肺外播散及藥物治療提供研究基礎。結核病潛伏期兔模型對于研究免疫發病機制、結核病階段性診斷、藥物抗持留結核分枝桿菌的功效上有著比較重要的作用。皮膚結核兔模型對于模擬人肺部的干酪樣壞死和液化，比較不同結核分枝桿菌的毒力、藥物篩選和新疫苗開發等方面的研究具有一定的優勢。骨關節結核兔模型對研究骨關節結核的發病機制、病理學及治療療效等奠定了一定基礎。結核性腦膜炎兔模型是一個非常有用的工具，對評估菌株毒力、疾病進展和病理以及測試新的候選疫苗療效也具有明顯的作用。一個好的疾病動物模型應具有：(1)生命周期能夠滿足實驗需要，并且動物遺傳背景資料完整；(2)再現性好，也就是可以模擬人類的疾病；(3)專一性強；(4)復制率高。根據結核病的研究內容不同，需要綜合考慮菌株毒力[22]、感染途徑[23]、感染部位、感染劑量、感染動物免疫力等，建立滿足實驗需要的結核病模型。

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2013-07-25)

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廣東省科學技術廳社會發展領域科技資助項目(編號：20120318095)

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