亞低溫對腦出血后血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ表達(dá)影響的研究

李曉玲，張 博，石正洪

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

亞低溫對腦出血后血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ表達(dá)影響的研究

李曉玲1，張 博2，石正洪1

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

目的 通過觀察亞低溫對實(shí)驗(yàn)性腦出血后的血腦屏障（BBB）、BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ的影響，進(jìn)一步探討亞低溫減輕血管源性腦水腫的機(jī)制。方法 將健康雄性SD大鼠（54只）隨機(jī)分為3組：生理鹽水組、腦出血組和亞低溫+腦出血組。采用自體血注入法建立腦出血模型，伊文思藍(lán)濃度測定BBB通透性、腦水含量（干濕重法），觀察各組大鼠BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ的表達(dá)（免疫組化法）。結(jié)果 腦出血24 h后BBB通透性開始增加，72 h達(dá)高峰，7 d后開始下降，其變化趨勢與腦水含量及BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ的表達(dá)一致。亞低溫+腦出血組的BBB通透性、腦水含量及BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ的表達(dá)均低于腦出血組。結(jié)論 腦出血后血管源性腦水腫的形成與BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ的高表達(dá)有關(guān)；亞低溫可以通過減少其表達(dá)來減輕BBB通透性的增加，減輕腦水腫，進(jìn)一步保護(hù)腦組織。

亞低溫；腦出血；血腦屏障；Rho激酶Ⅱ

腦出血占急性腦血管病的20%~30%，急性期的病死率約30%~40%，是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。腦出血后神經(jīng)功能惡化最重要的原因是腦水腫的形成。血腦屏障（BBB）破壞是腦出血后腦水腫發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要病理生理過程[1]。目前有報(bào)道顯示，Rho激酶的表達(dá)是導(dǎo)致炎癥等多種病理反應(yīng)過程中血管內(nèi)皮通透性升高的原因之一[2]。亞低溫已經(jīng)被證實(shí)可以減輕腦出血后腦水腫[3]，但能否通過對腦出血后BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ的變化產(chǎn)生影響尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察采用自體血注入法建立的大鼠腦出血模型BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ表達(dá)的變化來探討腦出血后腦水腫形成的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

SD雄性大鼠54只，鼠齡10～12個(gè)月，體重（275±25）g，由北京天壇醫(yī)院動(dòng)物房提供。將其隨機(jī)分為3組：生理鹽水組、腦出血組和亞低溫＋腦出血組。每組又分為腦出血后24 h、72 h、7 d 3個(gè)亞組。

1.2 方法

1.2.1腦出血模型 大鼠術(shù)前4 h禁食，2 h禁水，用10%水合氯醛以400 mg/kg劑量腹腔麻醉，俯臥位固定于動(dòng)物腦立體定位儀（美國Benchmark）上。頭皮正中切口，切開皮膚，剝離骨膜，暴露前囟及冠狀縫，前囟后1.0 mm、中線右3.0 mm處為注射穿刺點(diǎn)（右側(cè)基底節(jié)區(qū)尾狀核），用牙科鉆穿透顱骨，用微量注射器（寧波三愛）抽取股動(dòng)脈血50 ul，將注射器固定于立體定位儀上，將針尖置于穿刺點(diǎn)平顱骨，垂直進(jìn)針5.5 mm后，以微量注射泵（美國Benchmark）緩慢注入自體血。生理鹽水組與腦出血組同樣定位穿刺，注入50 μl生理鹽水。

1.2.2亞低溫處理具體方法 進(jìn)行亞低溫治療6 h。大鼠采用冰塊、醫(yī)用冰毯（大連歐姆龍）降溫，體溫采用肛溫法測定，用醫(yī)用電子溫度計(jì)（大連歐姆龍）間隔15 min監(jiān)測肛溫。亞低溫+腦出血組在腦出血后10 min內(nèi)將大鼠放在冰毯上用冰塊覆蓋降溫，約15 min左右降至（33.0±1.0）℃，腦出血組及生理鹽水組肛溫維持在（37.5±1.0）℃，并在大鼠蘇醒后（一般為3 h左右）再次給予10%水合氯醛以150 mg/kg劑量腹腔麻醉。大鼠6 h后在室溫下自動(dòng)復(fù)溫。

1.2.3冰凍切片制備 各組大鼠在出血后不同時(shí)間給予10%水合氯醛以400 mg/kg劑量腹腔麻醉，仰臥位固定于動(dòng)物腦立體定位儀上，剪開胸腹腔，夾閉下腔靜脈及胸主動(dòng)脈，4%多聚甲醛溶液250 ml經(jīng)心腔灌注固定，斷頭取腦，沿針孔冠狀面切開，將針孔后腦標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，后用20%蔗糖溶液脫水固定72 h，在注射針道平面切取腦組織塊后以冰凍切片機(jī)（Leica CM1850）行冰凍切片，每張厚度10 μm。

1.2.4 BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ免疫組化染色 按以下步驟進(jìn)行免疫組化染色：（1）去除玻片上多余的水分，滴加3%過氧化氫抑制5 min；滴加一抗1∶100（羊抗小鼠PAR-1抗體），4℃放置過夜，0.1 mol/L PBS液沖洗5 min，反復(fù)3次。（2）滴加生物素標(biāo)記的二抗（DAKO K0690），37℃放置30 min，0.1 mol/L PBS液沖洗5 min，反復(fù)3次。（3）滴加SABC，20~37℃放置30 min，0.1 mol/L PBS液沖洗5 min，反復(fù)3次。（4）DAB顯色，0.1 mol/ L PBS液沖洗。（5）蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。在彩色圖像分析儀上觀察可見血腫周圍微血管內(nèi)皮細(xì)胞漿有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。

1.2.5腦水含量的測定 取血腫周圍約150 mg腦組織在分析天平（200S）上稱濕重，然后將組織放入電熱烘箱中100℃烘烤24 h再稱干重。按下列公式計(jì)算腦水含量：

水含量=（濕重-干重）/濕重×100%

1.2.6 BBB通透性測定 大鼠在各時(shí)間點(diǎn)處死前2 h經(jīng)股靜脈注入2%伊文思藍(lán)溶液4 ml/kg，生理鹽水灌注后斷頭取腦。濾紙吸干大腦表面水分，在穿刺點(diǎn)前后橫切腦組織得到3 mm厚斷面。去除皮層后稱重，浸入2 ml 50%三氯乙酸中，37℃孵育3 d。每個(gè)樣品各取2 ml在激發(fā)波長620 nm、發(fā)生波長680 nm的多功能酶標(biāo)儀上測定伊文思藍(lán)的熒光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出伊文思藍(lán)含量（μg/g腦組織）。

1.3 定量方法

采用彩色圖像分析儀（BI－2000）進(jìn)行分析，將腦切片置于高倍鏡（400倍）下，在每張切片上隨機(jī)選取血腫周圍有毛細(xì)血管的5個(gè)視野，進(jìn)行積分光密度測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料兩兩比較，若方差齊用t檢驗(yàn)，若方差不齊多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1模型成功標(biāo)準(zhǔn)

以腦組織中有明顯的圓形、橢圓形或不規(guī)則的血腫存在為模型成功標(biāo)準(zhǔn)，血液針道反流進(jìn)入腦室，大鼠死亡者均摒除。同時(shí)參照Longa及Bederson5級(jí)評(píng)分法，2～3分作為成功模型入組。符合制作成功要求的模型54只。

2.2 腦出血后BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ的表達(dá)

血腫周圍區(qū)的BBB內(nèi)皮細(xì)胞上可見少量棕色顆粒。不同時(shí)間點(diǎn)比較：腦出血組Rho激酶Ⅱ表達(dá)于出血后24 h開始增加，72 h達(dá)到高峰，7 d后下降。3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較均P＜0.01。生理鹽水組Rho激酶Ⅱ在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異無顯著性（P＞0.05）。同一時(shí)間點(diǎn)比較：亞低溫+腦出血組Rho激酶Ⅱ的表達(dá)在24 h、72 h、7 d均低于腦出血組，差異有顯著性（P＜0.05），見表1。

表1 各組BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ表達(dá)的定量檢測結(jié)果（±s）

表1 各組BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ表達(dá)的定量檢測結(jié)果（±s）

注：*、△分別表示與亞低溫+腦出血組、生理鹽水組在同時(shí)間點(diǎn)比較P＜0.01，P＜0.05；#表示腦出血組各時(shí)間點(diǎn)比較P＜0.05；▲表示生理鹽水組各時(shí)間點(diǎn)比較P＞0.05

組別生理鹽水組腦出血組亞低溫＋腦出血組Rho激酶Ⅱ積分光密度24 h 72 h 7 d 432.15±123.32▲#2 035.01±732.75△#1 307.71±384.34△#496.12±147.07▲#3 809.60±962.19*##1 796.60±572.16##303.13±101.62 1 392.32±321.54 1 012.07±341.47▲#△#

2.3腦水含量的比較（見表2）

腦出血組大鼠注血后24 h腦水含量開始增加，72 h達(dá)到高峰，7 d后下降（P＜0.01）。亞低溫+腦出血組的腦水含量在24 h、72 h、7 d均低于腦出血組（P＜0.01）。

表2 各組腦水含量檢測結(jié)果（±s，%）

表2 各組腦水含量檢測結(jié)果（±s，%）

注：*表示與亞低溫+腦出血組在同時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.01，▲表示腦出血組各時(shí)間點(diǎn)比較P＜0.01

組別腦出血組亞低溫+腦出血組24 h 72 h 80.58±0.41*▲78.52±0.57*▲83.38±0.37*▲80.61±0.51*▲7 d 79.56±0.46*▲77.54±0.33*▲

2.4 BBB通透性的比較（見表3）

表3 各組伊文思藍(lán)含量的檢測結(jié)果（±s,μg/g腦組織）

表3 各組伊文思藍(lán)含量的檢測結(jié)果（±s,μg/g腦組織）

注：*表示腦出血組與亞低溫+腦出血組在同時(shí)間點(diǎn)比較P＜0.01，▲表示腦出血組各時(shí)間點(diǎn)比較P＜0.01

組別腦出血組亞低溫+腦出血組24 h 72 h 11.63±0.25*▲8.21±1.45▲*14.67±1.97*▲10.16±1.21▲*7 d 9.78±0.39*▲6.98±0.67▲*

3 討論

Rho激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，普遍表達(dá)在各種組織中。其有兩種基本亞型，即Rho激酶Ⅰ和Rho激酶Ⅱ，其中Rho激酶Ⅱ在腦組織中表達(dá)很高。Rho激酶底物包括肌球蛋白輕鏈磷酸酶、肌球蛋白、ERM、LIM激酶和cofilin[4]。BBB的基本結(jié)構(gòu)包括腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的緊密連接、周細(xì)胞、基膜與膠質(zhì)細(xì)胞終足。其中，腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的緊密連接是BBB的關(guān)鍵部位[5]。腦出血后血腫可以引起B(yǎng)BB的破壞進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生發(fā)展。研究表明，在兔蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锬Ｐ椭校鹾涎t蛋白介導(dǎo)的自由基反應(yīng)是通過Rho激酶的表達(dá)而引起腦血管痙攣[6]。為進(jìn)一步研究腦出血后Rho激酶是否參與了腦水腫的形成過程，本實(shí)驗(yàn)對Rho激酶Ⅱ的表達(dá)變化做了研究。

在本實(shí)驗(yàn)中采用自體血注入法建立了腦出血模型，取腦組織通過免疫組化法觀察BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ表達(dá)的陽性率。在顯微鏡下可以看到血腫周圍毛細(xì)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞上有棕色顆粒。出血后Rho激酶Ⅱ表達(dá)的變化同BBB通透性、腦水腫的變化一致（見表1、2）。生理鹽水組Rho激酶Ⅱ表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均低于腦出血組，這說明腦出血后產(chǎn)生的Rho激酶Ⅱ參與了腦水腫的形成。可能與腦出血后通過激活Rho激酶Ⅱ造成血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮引起通透性增加，破壞BBB造成的腦水腫有關(guān)。

亞低溫可以通過多種途徑來減輕腦出血后腦水腫，其中保護(hù)BBB，減輕其通透性是目前研究的熱點(diǎn)。但能否通過對Rho激酶Ⅱ的變化產(chǎn)生影響尚未見相關(guān)報(bào)道。代大偉等發(fā)現(xiàn)局部亞低溫可能是通過抑制凝血酶的毒性作用來減輕腦出血后腦水腫的形成及BBB通透性的破壞[7]。本研究為了更貼近腦出血的生理過程而采用自體血注入法，取腦組織后制作的腦切片用彩色圖像分析儀分析可以發(fā)現(xiàn)亞低溫+腦出血組的BBB內(nèi)皮細(xì)胞上Rho激酶Ⅱ的積分光密度值與腦出血組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（24 h、72 h、7 d）相比均P＜0.05。由此可見亞低溫可能通過降低腦出血后Rho激酶Ⅱ的表達(dá)來減輕腦水腫發(fā)揮其腦保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。在實(shí)驗(yàn)中可以看到Rho激酶Ⅱ表達(dá)在BBB內(nèi)皮細(xì)胞上，通過本實(shí)驗(yàn)可以推測亞低溫減輕出血后血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性也是保護(hù)BBB的機(jī)制之一[8]。

通過本實(shí)驗(yàn)我們可以看到腦出血后血腫周圍毛細(xì)血管壁上Rho激酶Ⅱ表達(dá)上調(diào)，其變化與腦水腫的變化一致，說明Rho激酶Ⅱ可能參與了腦出血后腦水腫的形成。同時(shí)，亞低溫+腦出血組的Rho激酶Ⅱ表達(dá)下調(diào)，可以推測降低血腫周圍BBB內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶Ⅱ的表達(dá)可能是其減輕腦水腫的機(jī)制之一，但具體機(jī)制還有待我們進(jìn)一步研究。

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1671-1246（2014）17-0140-03