全反式維甲酸對星形膠質細胞清除淀粉樣蛋白的影響及機制

韓 星，石 磊，嚴華成，曾曉暉，張 營，關 慧，趙樹進

(1南方醫科大學，廣州510515;2廣州軍區廣州總醫院)

在阿爾茨海默病(AD)的發病機制中，腦內淀粉樣蛋白(Aβ)產生與清除失衡，導致神經細胞內Aβ蓄積和沉積形成淀粉樣斑塊，以及Aβ的神經毒性是散發性AD最直接的病理因素［1］。在神經內源性免疫系統中，星形膠質細胞起著非常重要的作用。星形膠質細胞可以內化吞噬Aβ，降低神經細胞中Aβ含量［2］。維甲酸(RA)是機體正常發育不可越少的重要因子，RA信號參與調節胚胎發育，細胞增殖、分化、凋亡，維持正常的免疫功能，以及神經元的形成、存活［3］。在大腦皮層、海馬等區域存在RA受體，RA對各種神經退行性疾病有神經保護性作用。全反式維甲酸(ATRA)是人體內RA最主要的活性成分，因此ATRA可能抵抗Aβ對星形膠質細胞的神經毒性，調節細胞內Aβ含量。2013年1～12月，我們觀察了ATRA對星形膠質細胞清除Aβ的影響，并探討其分子機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清(Hyclone)、DMEM/F12培養基(Hyclone)、MTT(Sigma)、ATRA(Sigma)、Aβ42(上海楚肽生物科技有限公司)、小鼠GFAP抗體(Epitomics)、IgG-FITC(SanTa Cuz)、DAPI(Sigma)、APOE(兔單抗，Abcam)、BACE1一抗(Millipore)、HRP Goat anti-Rabbit IgG(CST)、β-actin(CST)、小鼠β-Amyloid ELISA試劑盒(上海西塘生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞培養 取出生1～2 d的新生C57乳鼠的大腦，分離大腦皮層并剪碎，胰酶消化過濾，取濾液離心棄上清，加入DMEM/F12培養基(含10%胎牛血清)吹打成細胞懸液，于37℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗［4］。

1.2.2 原代細胞鑒定 取生長狀態良好的細胞爬片，4%多聚甲醛固定，山羊血清封閉液封閉2 h，同時用 0.1%Triton X-100 破膜。GFAP(1∶300)孵育，4℃過夜。FITC(1∶200)室溫孵育2 h，同時用DAPI(10 μg/mL)染核。PBS沖洗，將細胞爬片轉移至載玻片上，滴加甘油封片。正置熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.3 MTT法檢測細胞存活率 取對數生長期細胞接種至96孔板，細胞數約為4 000個/孔，實驗分為6組，每組設6個平行復孔。細胞貼壁24 h后，棄培養基。實驗組中分別加入 200 μL含0.01、0.1、1、10 μmol/L 的 ATRA，且同時含有 2 μg/mL Aβ42培養基，對照組加入 200 μL 含有 2 μg/mL Aβ42培養基，正常組僅加入培養基。實驗組培養24 h后向每孔內加入MTT 20 μL(5 g/L)，孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min后酶標儀測定570 nm波長下各孔吸光度(OD)值，計算細胞存活率，細胞存活率=(實驗組組OD值－空白對照OD值)/(對照組OD值－空白對照OD值)×100%。實驗重復3次。

1.2.4 ELISA法檢測Aβ含量 取對數生長期細胞分為對照組和實驗組，每組設6個復孔。實驗組加入含 2 μg/mL Aβ42 和 1 μmol/L ATRA 的培養基，對照組加入含2 μg/mL Aβ42的培養基，孵育24 h后，分別收集兩組的培養基及星形膠質細胞。星形膠質細胞加入IP裂解液，收集上清液。采用小鼠β-Amyloid ELISA試劑盒分別檢測培養基、星形膠質細胞內的Aβ含量。

1.2.5 Western blot法檢測 APOE、BACE1 蛋白取對數生長期細胞，分為正常組、對照組和實驗組，分別加入培養基、含 2 μg/mL Aβ42的培養基、含μg/mL Aβ42和1 μg/mL ATRA 的培養基，孵育 24 h后，分別收集各組星形膠質細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測總蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉:一抗4℃過夜，次日二抗孵育1 h。化學發光，顯影，定影。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析條帶光密度值。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS13.0軟件統計，結果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(并做方差齊性檢驗)，多組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代星形膠質細胞純度鑒定 采用GFAP、DAPI共染細胞的方法鑒定星形膠質細胞。GFAP免疫熒光陽性者呈綠色熒光，即為星形膠質細胞。結果顯示，星形膠質細胞純度＞95%。

2.2 不同濃度ATRA對星形膠質細胞存活率的影響 正常組、對照組及 0.01、0.1、1、10 μmol/L 實驗組的細胞存活率分別為(100±3.57)%、(88.7±1.96)%、(93.3 ±2.93)%、(94.7 ±2.27)%、(95.1±1.88)%、(89.7 ±2.40)%。對照組存活率明顯低于正常組，各實驗組存活率均高于對照組(P＜0.05或 ＜0.01)。

2.3 ATRA對星形膠質細胞Aβ清除的影響 對照組與實驗組細胞外培養基中Aβ的相對表達量分別為(100 ±2.36)%、(100 ±1.49)%，細胞內培養基中Aβ 的相對表達量分別為(85.53 ±7.71)%、(59.30 ±1.11)%。實驗組細胞內和細胞外培養基中的Aβ含量較對照組均明顯下降(P＜0.05或＜0.01)。

2.4 ATRA對BACE1、APOE表達的影響 正常組、對照組、實驗組的APOE相對表達量分別為0.194±0.030、0.413 ±0.062、0.472 ±0.098，BACE1 相對表達量分別為 0.129 ± 0.030、0.138 ± 0.045、0.114 ±0.036。對照組APOE表達較正常組明顯增加，實驗組較對照組明顯增加(P均＜0.01)。各組BACE1表達無統計學差異(P均＞0.05)。

3 討論

Aβ是β-分泌酶和γ-分泌酶的綜合裂解產物，是神經退行性疾病的生物標志物［5］。Aβ的聚集、沉淀形成淀粉樣斑塊，進而誘發膠質細胞的神經炎癥反應，導致神經功能紊亂，是AD的主要病理變化［6］。星形膠質細胞在維持CNS的內環境穩態中發揮重要作用，同時也是CNS系統中最重要的免疫細胞。

APOE ε4等位基因是散發型AD的主要危險因子，APOE4對Aβ的親和力低的缺陷導致細胞內Aβ清除減弱，從而促進 Aβ 聚集［7］。但 APOE2、APOE3對Aβ更具親和力，抑制Aβ聚集，促進內含體對Aβ的內吞作用，增加細胞內 Aβ的清除［8］。Cramer等［9］研究發現，過氧化物酶增殖激活受體激動劑貝莎羅丁可以直接誘導AD轉基因APOE表達上調，增加腦內Aβ的清除，明顯改善小鼠的認知功能障礙。因此認為，APOE2、APOE3能夠促進細胞內Aβ的清除，對神經細胞具有保護性作用。

RA信號通路參與調節胚胎發育，細胞增殖、分化、凋亡，維持正常的免疫功能，以及神經元的形成、存活［10］，參與神經退行性疾病的發生與發展，與AD有密切聯系。本研究發現，ATRA可以促進APOE的表達顯著增加，減少星形膠質細胞內Aβ聚集，具有一定的神經保護作用。這可能由于ATRA信號可以激活 LXR/RXR、PPARγ/RXR等受體，誘導APOE、ABCA1等表達上調，增加 Aβ的清除率［10，11］。同時發現高濃度的 ATRA 對星形膠質細胞具有一定毒性，其分子機制不明確。ATRA具有抗氧化應激損傷、抗炎作用、促進 α-分泌酶裂解APP、誘導ApoE表達等作用，其分子機制涉及各個環節［12，13］，仍需進一步深入研究。

［1］Querfurth HW，La Ferla FM.Mechanisms of disease［J］.N Engl J Med，2010，362(4):329-344.

［2］Rivest S.Regulation of innate immune responses in the brain［J］.Nat Rev Immunol，2009，9(6):429-439.

［3］Lane MA，Bailey SJ.Role of retinoid signalling in the adult brain［J］.Prog Neurobiol，2005，75(4):275-293.

［4］周欣，明曉云，康頌建，等.差速貼壁技術對大鼠腦皮質星形膠質細胞純化率的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(15):2.

［5］Hardy JA，Higgins GA.Alzheimer＇s disease:the amyloid cascade hypothesis［J］.Science，1992，256(5054):184-185.

［6］Blennow K，de Leon MJ，Zetterberg H.Alzheimer＇s disease［J］.Lancet，2006，368(9533):387.

［7］Poirier J，Bertrand P，Poirier J，et al.Apolipoprotein E polymorphism and Alzheimer＇s disease［J］.The Lancet，1993，342(8873):697-699.

［8］Verghese PB，Castellano JM，Holtzman DM.Apolipoprotein E in Alzheimer＇s disease and other neurological disorders［J］.The Lancet Neurology，2011，10(3):241-252.

［9］Cramer PE，Cirrito JR，Wesson DW，et al.ApoE-directed therapeutics rapidly clear β-amyloid and reverse deficits in AD mouse models［J］.Science，2012，335(6075):1503-1506.

［10］Citron M.Alzheimer＇s disease:strategies for disease modification［J］.Nat Rev Drug Discov，2010，9(5):387-398.

［11］Chen J，Costa LG，Guizzetti M.Retinoic acid isomers up-regulate ATP binding cassette A1 and G1 and cholesterol efflux in rat astrocytes:implications for their therapeutic and teratogenic effects［J］.J Pharmacol Exp Ther，2011，338(3):870-878.

［12］Sodhi RK，Singh N.Retinoids as potential targets for Alzheimer＇s disease［J］.Pharmacology Biochemistry and Behavior，2014，120:117-123.

［13］Nomoto M，Takeda Y，Uchida S，et al.Dysfunction of the RAR/RXR signaling pathway in the forebrain impairs hippocampal memory and synaptic plasticity［J］.Mol Brain，2012，5:8.