改良線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞動(dòng)物模型的效果觀察

孫長青，賀 瑋，李偉光，李志慧，張成崗

(1天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院，天津301800;2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，全軍軍事認(rèn)知與心理衛(wèi)生研究中心)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，80%的卒中是由于大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域的缺血性破壞導(dǎo)致［1～3］。腦缺血損傷動(dòng)物模型是研究腦血管疾病損傷機(jī)制和防治措施不可缺少的工具［4，5］。大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)［6］是卒中研究領(lǐng)域常見的模型制備方法［7］，目前最常用的是線栓法［8，9］。線栓法制備的卒中動(dòng)物模型神經(jīng)病理和認(rèn)知障礙損傷程度均相對較輕，適合作為腦血管疾病動(dòng)物模型。2012年9月～2013年6月，我們使用體視顯微鏡、顯微鑷子和留置針對傳統(tǒng)線栓法進(jìn)行改良，觀察改良線栓法制備腦缺血損傷動(dòng)物模型的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級成年SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。模型制作前12 h禁食不禁水，隨機(jī)分為改良組(改良線栓法)和傳統(tǒng)組(傳統(tǒng)線栓法)，每組30只。

1.2 材料 器械:麻醉機(jī)(美國Midmark公司);體視顯微鏡(天津醫(yī)用光學(xué)儀器廠);顯微外科手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠);自制金屬拉鉤;一次性使用靜脈留置針(威海潔瑞醫(yī)用制品有限公司);麻醉劑異氟烷(上海雅培制藥有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 傳統(tǒng)線栓法［10］10%水合氯醛腹腔注射麻醉傳統(tǒng)組大鼠后，頸部手術(shù)區(qū)備皮、消毒，頸部正中切口;右側(cè)頸動(dòng)脈鞘處分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎翼腭突動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈。在頸總動(dòng)脈結(jié)扎處遠(yuǎn)心端剪一斜切口，插入栓線;進(jìn)線17～21 mm時(shí)，感到明顯阻力，證明栓線頭端已達(dá)大腦中動(dòng)脈起始處;在頸總動(dòng)脈插口結(jié)扎固定栓線，逐層縫合。

1.3.2 改良線栓法 改良組大鼠麻醉(麻醉機(jī))后，平臥固定于手術(shù)臺，頸部用碘伏原液進(jìn)行消毒，旁正中切開，切口長2～4cm;分離肌肉后可見到頸動(dòng)脈，通過自制拉鉤牽拉皮膚和肌肉以完整暴露手術(shù)視野;體視顯微鏡下操作，輕柔分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，勿傷及迷走神經(jīng);結(jié)扎頸外動(dòng)脈，并在頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈，同時(shí)在頸總動(dòng)脈下備線，然后用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈;顯微鑷子末端置于頸總動(dòng)脈結(jié)扎和備線部位之間的下方，使用一次性靜脈留置針將顯微鑷子兩末端上的頸總動(dòng)脈刺破一孔，可見血液流入留置針內(nèi);顯微鑷子不動(dòng)，撤掉留置針，將大鼠用線栓沿刺破的頸總動(dòng)脈孔插入頸總動(dòng)脈，并用彎頭眼科鑷將尼龍線栓經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)推送至大腦中動(dòng)脈開口處，以阻斷大腦中動(dòng)脈血流;尼龍線栓插入深度為從頸總動(dòng)脈分叉部起18～20 mm，并用頸總動(dòng)脈下的備線結(jié)扎，以防線栓拔出，然后剪掉多余線栓并縫合切口。術(shù)后大鼠置于安靜溫暖處飼養(yǎng)。參照Zea Longa評定進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的評價(jià):0級為無缺陷;1級為不能伸展對側(cè)前肢;2級為對側(cè)前肢屈曲;3級為輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;4級為嚴(yán)重的轉(zhuǎn)圈;5級為對側(cè)癱瘓。3～4級為模型制作成功。

1.3.3 觀察指標(biāo) 比較兩組造模成功率、手術(shù)時(shí)間、術(shù)中出血量及神經(jīng)損傷情況。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

改良組失敗1只、死亡2只、成功27只，成功率90.00%(27/30);傳統(tǒng)組失敗4只、死亡6只、成功20只，成功率66.67%(20/30);兩組成功率比較，P＜0.05。改良組神經(jīng)損傷1只(3.70%)，傳統(tǒng)組5只(25.00%)，P ＞ 0.05。改良組手術(shù)時(shí)間(24.04±2.87)min，傳統(tǒng)組(49.95±5.79)min，P ＜0.01。改良組術(shù)中出血量(1.79±0.72)mL，傳統(tǒng)組(3.53±1.07)mL，P ＜0.01。

3 討論

線栓法制備的大鼠局灶性腦缺血再灌注模型［9］，是模擬缺血性卒中患者最常見的動(dòng)物模型，具有創(chuàng)傷性小、缺血效果肯定、重復(fù)性好、無需開顱、可準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時(shí)間、大腦中動(dòng)脈閉塞及再灌注效果好等優(yōu)點(diǎn)［11，12］。傳統(tǒng)線栓法制備MCAO模型是提拉頸總動(dòng)脈下的備線用剪刀剪破［13，14］，或者用注射器針頭刺破頸總動(dòng)脈和進(jìn)行線栓插入，手術(shù)操作在肉眼下進(jìn)行。使用剪刀剪破血管時(shí)，在動(dòng)脈上剪口不易控制口徑大小;口徑邊緣銳利，提拉時(shí)容易斷開;很容易剪斷血管;即使剪得很好，但由于血液流出而導(dǎo)致血管塌陷，在插入線栓時(shí)還需要花費(fèi)一定時(shí)間才能找到管腔;導(dǎo)致MCAO模型不易成功。而采用注射器針頭刺破血管的方法很容易把整個(gè)血管都穿透，甚至穿斷。使用留置針代替注射器針頭進(jìn)行操作時(shí)，由于留置針的末端比針頭斜面短很多，但銳利程度相同，很容易進(jìn)入血管腔而不穿透血管，而且留置針末端進(jìn)入血管后很快看見血液流出，此時(shí)血管的破孔直徑可以讓線栓順利進(jìn)入，同時(shí)也能夠防止留置針繼續(xù)向血管腔內(nèi)進(jìn)入。初做MCAO模型的人對于頸內(nèi)外動(dòng)脈的區(qū)分往往有一定困難，通?？筛鶕?jù)血管的命名來判斷，即頸內(nèi)動(dòng)脈在后外側(cè)，頸外動(dòng)脈在前內(nèi)側(cè);還可根據(jù)頸內(nèi)動(dòng)脈和迷走神經(jīng)包裹在動(dòng)脈鞘內(nèi)來判斷，也就是說與迷走神經(jīng)伴行的血管一定是頸內(nèi)動(dòng)脈。

改良線栓法中使用體視顯微鏡和留置針等技術(shù)，操作更快、更容易，模型成功率更高。該方法的優(yōu)點(diǎn)包括:①全程在體視顯微鏡下操作，使血管和神經(jīng)甚至分支都看得非常清楚，避免了人為損傷。在使用體視顯微鏡之前，MCAO模型制作中曾經(jīng)出現(xiàn)過模型雖然成功但是大鼠的氣管卻總是發(fā)出“吼吼”的聲音，后經(jīng)檢查，發(fā)現(xiàn)其原因是損傷了迷走神經(jīng)或其分支，尤其在夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈時(shí)一些細(xì)小的神經(jīng)肉眼是看不到的，或者因?yàn)橐曇笆芟迣⑽纯匆姷纳窠?jīng)部分一起夾閉。在使用體視顯微鏡操作后上述現(xiàn)象極少出現(xiàn)。本研究改良組1只大鼠發(fā)生神經(jīng)損傷，是因?yàn)樵诜蛛x神經(jīng)和血管時(shí)鑷子末端不圓頓而損傷神經(jīng)所致。我們的結(jié)論雖然兩組在神經(jīng)損傷上差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但如果排除這1只器械原因引起損傷外應(yīng)該還是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的，所以結(jié)論上我們認(rèn)為改良方法可以減少神經(jīng)損傷的發(fā)生。②在體視顯微鏡下植入線栓時(shí)可以清楚地看見線栓進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈以及進(jìn)入標(biāo)志處，使手術(shù)更加容易。③自制拉鉤的應(yīng)用使手術(shù)視野暴露得非常好，但是由于肌肉具有彈性，必須讓拉鉤能剛剛阻擋住肌肉回縮即可，牽拉強(qiáng)度不能太大，以免損傷其他組織。④在進(jìn)行血管刺破時(shí)，使用鑷子固定血管代替絲線牽拉。鑷子固定血管非常穩(wěn)固，血管不會滑動(dòng)，也不會翻動(dòng)，節(jié)省時(shí)間;絲線牽拉很容易出現(xiàn)血管滑動(dòng)和翻動(dòng)，不利于后面的操作。⑤插入線栓時(shí)仍需要將鑷子置于原來的位置不動(dòng)，一方面血管不動(dòng)容易看見其上面的破孔，有利于線栓的進(jìn)入;另一方面，鑷子的末端由兩個(gè)分叉組成，遠(yuǎn)心端的分叉還能起到阻斷血流、止血的作用，減少出血的幾率。

本研究改良組造模成功率明顯高于傳統(tǒng)組，神經(jīng)損傷、手術(shù)時(shí)間、術(shù)中出血均少于傳統(tǒng)組。造模成功率提高除了與應(yīng)用顯微外科技術(shù)有關(guān)外，還與術(shù)者手術(shù)經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)水平有關(guān)，所以要求進(jìn)行此模型制作的人員應(yīng)先進(jìn)行外科操作方面的培訓(xùn)，以進(jìn)一步提高造模成功率。

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