心房顫動早期階段心房肌細胞小電導鈣激活鉀通道的功能改變

于 濤，劉 影，俞曉立，林 偉

(廣州醫科大學附屬第二醫院，廣州510260)

心房顫動(AF)是臨床常見病，心房重構是其重要病理生理基礎。小電導鈣激活鉀(SK)通道是鈣激活鉀通道家族成員，包括3種亞型(SK1～3)，是介導細胞內Ca2+調控與細胞膜電活動的重要離子通道。近年來發現，SK通道呈“心房選擇性”分布，且與AF發生密切相關。本課題組前期工作［1］首次證實，慢性AF患者心房肌細胞SK1、SK2亞型下調。但在AF早期階段，SK通道功能如何變化卻存在爭議。本研究觀察SK通道在AF早期階段心房肌細胞中的功能變化并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 成年雄性比格犬8只，體質量13～15 kg。分為快速心房起搏組5只與對照組3只。

1.2 方法

1.2.1 快速心房起搏犬模型的制備 快速心房起搏組犬置于無菌環境、全麻狀態下(氯胺酮5.0 mg/kg+地西泮 0.2 mg/kg，靜脈注射;1.5%異氟醚吸入)，氣管插管后機械通氣(潮氣量10 mL/kg，頻率20次/min)，于胸骨右緣第5肋間開胸，暴露心臟將起搏電極縫合在右心耳部，起搏器(華南理工大學電子研究所制作，輸出電壓4 V，脈寬0.5 ms)頻率調至400次/min，持續起搏4 h。對照組手術方法相同，但不進行起搏。

1.2.2 膜片鉗全細胞記錄

1.2.2.1 心房肌細胞分離 采用自制改良的Langendorff灌流法和自制的冠脈插管裝置［2］。分離后的左心房肌細胞保存在改良KB液中，室溫下靜置孵育6 h后進行實驗。

1.2.2.2 全細胞鈣激活鉀電流(IK，Ca)記錄 選取紋理清晰、桿狀和大小適中的細胞在24℃條件下進行實驗。將適量細胞(約1.5 mL)放于倒置顯微鏡(OLPUS IX 70型，日本)的細胞池中，貼壁8 min后，開始實驗，灌流速度約1.5 mL/min。在電極拉制儀(Narishige PP830型，日本)分兩部拉制電極，灌電極液后電阻為2～4 MΩ，并置于推進器上，通過三維操縱器(Narishige，日本)驅動電極，并輕壓在細胞表面。用負壓使電極與細胞表面形成高阻封接后，用ZAP或給負壓破膜，給予電容及串聯電阻補償，形成全細胞記錄。電流信號經Ag/AgCl電極引導，由膜片鉗AXON 200B放大器放大通過AD/DA轉換板(AXON DigiDatal 200，美國)，存儲于計算機硬盤中。實驗過程由pClAMP9.0軟件程序(AXON，美國)刺激發放和信號采集。采用pCLAMP9.0軟件對單個全細胞記錄進行數據和圖形轉換，Prism3.0軟件對數據進行曲線擬合及繪制離子通道電流密度—電壓(Ⅰ-Ⅴ)曲線。根據文獻［3，4］，本研究中將電極內液的游離 Ca2+濃度設定為1 000 nmol/L，以最大限度地保證SK通道激活。形成全細胞封接狀態后，將細胞鉗制在－55 mV，給予指令電位從－100 mV～+80 mV，步長20 mV，波寬為500 ms的刺激。記錄用藥前電流后，用含SK通道特異性阻斷劑蜂毒明肽(100 nmol/L)的電極外液灌流3 min，再次記錄電流，給蜂毒明肽前后的電流相減獲得“蜂毒明肽敏感性電流”，此電流即“IK，Ca”。記錄每個細胞電容，計算電流密度(pA/pF)=電流(pA)/電容(pF)。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件。數據以±s表示，組間數據比較采用Student's t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

全部犬順利完成實驗，每只犬至少取3個心房肌細胞進行膜片鉗實驗。當鉗制電位為－100 mV時，快速心房起搏組心房肌細胞電流密度為(－1.7±0.3)pA/pF，對照組為(－0.7±0.1)pA/pF，P ＜0.01;+80 mV時，快速心房起搏組心房肌細胞電流密度為(4.1±0.6)pA/pF，對照組為(－1.6±0.2)pA/pF，P ＜0.01。

3 討論

SK通道家族的特性是電壓非依賴性、僅由細胞內的Ca2+激活和可被蜂毒明肽特異性阻斷，蜂毒明肽對SK通道有高度選擇性，對其他離子通道則不敏感［5］。

SK通道是細胞內的鈣調控和細胞膜的電活動之間的重要功能鏈接［6］。AF的發生、發展與離子通道表達異常和細胞內的鈣調控失常密切相關［7］。Li等［8］發現，SK2基因敲除小鼠的心肌細胞動作電位延長，更易于誘發 AF。Ellinor等［9］發現，人類1q21位點的KCNN3(SK3)基因多態性與孤立性AF的發生相關。最近3項動物實驗［10～12］結果顯示，阻斷SK通道可以中止AF的發作，提示SK通道可能是一種新型的AF相關性離子通道［13］。Tuteja等［3］和Xu等［4］的研究證實，SK1和SK2通道呈“心房選擇性”分布。該特性使SK通道極有可能成為新的“選擇性”治療AF的藥物靶點［14］，即特異性阻斷SK通道的藥物可以有效治療或預防AF，且無其他抗心律失常藥物常見的致室性心律失常的風險。

我們的前期實驗［1］已經證實，慢性AF(AF維持階段)患者心房肌細胞中IK，Ca電流密度減低、SK1和SK2表達下調。但Nagy等［15］報道，在生理狀態下，大鼠、犬和人心室肌細胞的SK2通道處于失活狀態，對動作電位的復極化過程不產生影響。Ozgen等［16］的研究顯示，短時間(3 h)快速起搏(模擬AF早期階段)可使兔肺靜脈肌袖細胞IK，Ca電流密度增強，SK2亞型表達增加，但該研究是在離體組織模型上進行的。本研究采用活體犬AF模型，結果顯示IK，Ca電流密度在AF早期階段增強。該結果與Nagy等［15］的研究結果吻合。這說明SK通道在AF的不同時期功能變化不同，即SK通道在AF初始(早期)階段和維持階段(慢性AF)呈“矛盾性重構”改變。

綜上所述，SK通道的功能上調是AF初始階段的重要分子機制之一。由此推測，未來開發新型的特異性SK通道阻斷劑，并預防性應用于AF高危人群中，可能大大降低AF的發生率。

［1］Yu T，Deng C，Wu R，et al.Decreased expression of small-conductance Ca2+-activated K+channels SK1 and SK2 in human chronic atrial fibrillation［J］.Life Sci，2012，90(5-6):219-227.

［2］于濤，吳若彬，鄧春玉，等.犬左心房心肌細胞的分離方法及電生理記錄［J］.廣東醫學，2010，31(24):3157-3159.

［3］Tuteja D，Xu D，Timofeyev V，et al.Differential expression of small-conductance Ca2+-activated K+channels SK1，SK2，and SK3 in mouse atrial and ventricular myocytes［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289(6):2714-2723.

［4］Xu Y，Tuteja D，Zhang Z，et al.Molecular identification and functional roles of a Ca2+-activated K+channel in human and mouse hearts［J］.J Biol Chem，2003，278(49):49085-49094.

［5］Strobaek D，Jorgensen TD，Christophersen P，et al.Pharmacological characterization of small-conductance Ca2+-activated K+channels stably expressed in HEK 293 cells［J］.Br J Pharmacol，2000，129(5):991-999.

［6］Weatherall KL，Goodchild SJ，Jane DE，et al.Small conductance calcium-activated potassium channels:from structure to function［J］.Prog Neurobiol，2010，91(3):242-255.

［7］Nattel S.New ideas about atrial fibrillation 50 years on［J］.Nature，2002，415(6868):219-226.

［8］Li N，Timofeyev V，Tuteja D，et al.Ablation of a Ca2+-activated K+channel(SK2 channel)results in action potential prolongation in atrial myocytes and atrial fibrillation［J］.J Physiol，2009，587(Pt 5):1087-1100.

［9］Ellinor PT，Lunetta KL，Glazer NL，et al.Common variants in KCNN3 are associated with lone atrial fibrillation［J］.Nat Genet，2010，42(3):240-244.

［10］Diness JG，Sorensen US，Nissen JD，et al.Inhibition of smallconductance Ca2+-activated K+channels terminates and protects against atrial fibrillation［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2010，3(4):380-390.

［11］Diness JG，Skibsbye L，Jespersen T，et al.Effects on atrial fibrillation in aged hypertensive rats by Ca2+-activated K+channel inhibition［J］.Hypertension，2011，57(6):1129-1135.

［12］Skibsbye L，Diness JG，Sorensen US，et al.The duration of pacing-induced atrial fibrillation is reduced in vivo by inhibition of small conductance Ca2+-activated K+channels［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2011，57(6):672-681.

［13］Wakili R，Voigt N，Kaab S，et al.Recent advances in the molecu-lar pathophysiology of atrial fibrillation［J］.J Clin Invest，2011，121(8):2955-2968.

［14］Nattel S.Calcium-activated potassium current:a novel ion channel candidate in atrial fibrillation［J］.J Physiol，2009，587(Pt 7):1385-1386.

［15］Nagy N，Szuts V，Horvath Z，et al.Does small-conductance calcium-activated potassium channel contribute to cardiac repolarization［J］.J Mol Cell Cardiol，2009，47(5):656-663.

［16］Ozgen N，Dun W，Sosunov EA，et al.Early electrical remodeling in rabbit pulmonary vein results from trafficking of intracellular SK2 channels to membrane sites［J］.Cardiovasc Res，2007，75(4):758-769.