依達拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細胞NF—κB和IL—6，IL—8表達及凋亡的影響

王媛媛+曹建+陳勤+等

1.南昌市第三醫院心內科，江西南昌 330009；2.南昌大學第二附屬醫院麻醉科，江西南昌 330006

[摘要] 目的 探討依達拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的影響及NF-κB和白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）表達。 方法 體外培養肺泡Ⅱ型上皮細胞，用過氧化氫氧化應激建立肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡細胞模型，將細胞分為對照組、過氧化氫組、依達拉奉-過氧化氫組。用MTT法檢測依達拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細胞增殖能力的影響，流式細胞儀檢測依達拉奉對氧化應激肺泡Ⅱ型上皮細胞細胞凋亡的影響，采用ELISA試劑盒及谷胱甘肽（GSH）、脂質過氧化物（MDA）試劑盒檢測IL-6、IL-8及GSH、MDA含量，用Western-blot方法檢測氧化應激肺泡Ⅱ型上皮細胞中的NF-κB蛋白表達。 結果 依達拉奉-過氧化氫組細胞生長抑制率為（22.3±3.1）%，明顯低于過氧化氫組[（37.5±2.4）%]，差異有統計學意義（P < 0.05）。依達拉奉-過氧化氫組MDA含量低于過氧化氫組，GSH含量高于過氧化氫組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。依達拉奉-過氧化氫組IL-6、IL-8含量低于過氧化氫組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。依達拉奉-過氧化氫組細胞凋亡率[（14.67±0.50）%]明顯低于過氧化氫組[（38.88±0.80）%]，差異有統計學意義（P < 0.05）。過氧化氫+依達拉奉組NF-κB蛋白水平（2.106±0.012）低于過氧化氫組（4.216±0.127），差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 依達拉奉具有抑制氧化應激后所誘導肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡、下調NF-kB和IL-6、IL-8表達的作用。

[關鍵詞] 依達拉奉；氧化應激；核因子-κB；白介素-6；白介素-8；肺泡Ⅱ型上皮細胞；凋亡

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）03（a）-0008-05

Effects of Edaravone on apoptosis and the expressions of NF-κB， IL-6， IL-8 in lung epithelial type Ⅱ cells

WANG Yuanyuan1 CAO Jian2 CHEN Qin1 OUYANG Xianguo1 SONG Guoliang1

1.Department of Cardiology， the Third Hospital of Nanchang City， Jiangxi Province， Nanchang 330009， China； 2.Department of Anesthesiology， the Second Affiliated Hospital of Nanchang University， Jiangxi Province， Nanchang 330006， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Edaravone on apoptosis and the expressions of NF-κB， IL-6， IL-8 in lung epithelial type Ⅱ cells. Methods Lung epithelial type Ⅱ cells were cultured in vitro， the apoptosis of lung epithelial type Ⅱ cells model was established by hydrogen peroxid. Lung epithelial type Ⅱ cells were divided into three groups： control group， hydrogen peroxide group and edaravone-hydrogen peroxide group， lung epithelial type Ⅱ cells was treated by edaravone. The proliferation rate of lung epithelial type Ⅱ cells were detected by MTT； the apoptosis rate of lung epithelial type Ⅱ cells was determined though flow cytometry； the expression of IL-6， IL-8， GSH， MDA was detected by ELISA kit， GSH kit， MDA kit， the NF-κB protein expression after edaravone treatment was examined through Western-blot. Results Cell growth inhibition rate in edaravone-hydrogen peroxide group [（22.3±3.1） %] was lower than that in hydrogen peroxide group [（37.5±2.4） %]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. MDA content in edaravone-hydrogen peroxide group was lower than that in hydrogen peroxide group， GSH content in edaravone-hydrogen peroxide group was higher than that in hydrogen peroxide group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. IL-6， IL-8 content in edaravone-hydrogen peroxide group was lower than that in hydrogen peroxide group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Cell apoptosis rate in edaravone-hydrogen peroxide group [（14.67±0.50） %] was lower than that in hydrogen peroxide group [（38.88±0.80） %]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. NF-κB protein level in edaravone-hydrogen peroxide group （2.106±0.012） was lower than that in hydrogen peroxide group （4.216±0.127）， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Edaravone can inhibit lung epithelial type Ⅱ cells apoptosis against -oxidative stress and down-regulate the expressions of NF-κB and IL-6， IL-8.

[Key words] Edaravone； Oxidative stress； NF-κB； IL-6； IL-8； Lung epithelial type Ⅱ cells； Apoptosis

急性肺損傷發病過程中，細胞因子可能通過抑制炎癥細胞凋亡延長炎性反應時間，促進肺泡上皮細胞凋亡而參與急性肺損傷的炎性反應過程[1]。肺泡Ⅱ型上皮細胞是肺部特異性細胞，可以分泌肺泡表面活性物質，能降低肺泡表面張力，對穩定肺泡形態有一定作用。Ⅱ型細胞又是肺泡的儲備細胞，當肺上皮遭受損害，會導致其增生，它是急性肺損傷發病過程中的重要效應細胞[2]。依達拉奉目前研究表明具有清除自由基，抑制氧化性應激，抑制細胞凋亡，可用于治療氧化應激介導細胞凋亡的神經退行性疾病[3]。本研究通過建立氧化應激誘導肺泡Ⅱ型上皮細胞細胞凋亡模型，探討依達拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的影響及其與炎癥因子的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640培養基HEPES，四氮唑藍（MTT），二甲基亞砜（DMSO）小牛血清（Gibico公司），IL-6，IL-8 ELISA試劑盒：武漢博士德公司。AnnexinⅤ-PI凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物技術有限公司），堿性磷酸酶（AP）顯色底物，anti-NF-κB，小鼠單抗辣根酶標記兔抗山羊IgG；anti-β-actin山羊單抗（SantaCruz產品）。依達拉奉（先聲藥業）。

1.2 人肺泡Ⅱ型上皮細胞的培養及誘導氧化應激

人肺泡Ⅱ型上皮細胞由南昌大學第二附屬醫院呼吸內科實驗室凍存。細胞用含10%小牛血清的RPMI1640培養液在5%CO2，37℃，飽和濕度的細胞培養箱培養，細胞呈貼壁生長，用0.25%的胰酶和0.02%EDTA（1∶1）消化傳代，用于實驗的細胞均處于指數生長期。根據文獻[4]報道方法，分別選用0.1、0.5、1.0 mmol/L過氧化氫（H2O2）處理肺泡Ⅱ型上皮細胞24 h。實驗分為對照組（無H2O2處理的肺泡Ⅱ型上皮細胞）、過氧化氫處理的過氧化氫組及依達拉奉（20 μmol/L）-過氧化氫處理的依達拉奉-過氧化氫組。

1.3 肺泡Ⅱ型上皮細胞體外生長活性的檢測（MTT法）及谷胱甘肽（GSH），脂質過氧化物（MDA）含量測定

取指數生長期的肺泡Ⅱ型上皮細胞，分別用生理鹽水及各濃度過氧化氫（0.1、0.5、1.0 mmol/L）處理，采用0.25%胰蛋白酶消化，以不含細胞的培養液做空白對照。以1×104/孔的密度接種于96孔板，每孔設3個復孔。觀察肺泡Ⅱ型上皮細胞貼壁后，加入20 μmol/L依達拉奉，置于孵箱（37℃，CO2）培養24、48、72 h。再加入MTT 20 μl顯色，吸棄孔內上清液，每孔加入DMSO，震搖15 min溶解結晶，用酶聯免疫儀測490 nm處的吸光度（A490）值。肺泡Ⅱ型上皮細胞生長抑制率=（1-實驗組平均A490值/對照組平均A490值）×100%。采用GSH試劑盒，MDA試劑盒檢測GSH、MDA含量。

1.4 酶聯免疫吸附試驗

人肺泡Ⅱ型上皮細胞按1×104/孔接種于96孔板上，分為對照組、氧化應激組、依達拉奉-過氧化氫組，培養結束后收集上清，根據預實驗結果對上清進行適當稀釋，按ELISA試劑盒說明進行試驗。

1.5 AnnexinV-PI

雙標記法分析肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡率。如上法收集氧化應激組及藥物處理72 h后各組細胞，將細胞收獲后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，-20℃ 75%乙醇固定過夜，取出離心收集細胞，PBS洗滌2次，加入10 g/L Rnase 37℃孵育15 min，再加入碘化丙錠（PI）染色30min，尼龍網過濾，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，采用CELIQUEST 軟件分析早期細胞凋亡率。

1.6 Western blot法檢測NF-κB蛋白水平

取對照組、過氧化氫組、依達拉奉-過氧化氫組細胞，加入細胞裂解液，提取總蛋白，收集上清液，考馬斯亮藍法進行擔保定量。SDS-PAGE分離樣品后電泳轉移至硝酸纖維膜上，TBST常溫下封閉過夜后，分別加入anti-NF-κB小鼠單抗（一抗）、室溫下免疫沉淀1 h，加入辣根酶標記兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，顯色。用Gel-ProAnalyzer分析軟件分析通道蛋白的灰度值。

1.7 統計學方法

采用統計軟件SPSS 15.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 依達拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細胞生長增殖能力的影響

過氧化氫氧化應激處理肺泡Ⅱ型上皮細胞后，過氧化氫組細胞生長抑制率為（37.5±2.4）%，明顯高于對照組的（3.8±0.8）%，差異有高度統計學意義（P < 0.01），氧化應激可以導致細肺泡Ⅱ型上皮細胞的增殖能力下降。依達拉奉干預后，依達拉奉-過氧化氫組細胞生長抑制率為（22.3±3.1）%，與過氧化氫組比較，細胞生長抑制率下降，差異有統計學意義（P < 0.05），細胞的增殖能力較前升高。提示依達拉奉-過氧化氫組可以改善氧化應激對肺泡Ⅱ上皮細胞的細胞抑制，提高細胞增殖能力。見表1。

表1 各組肺泡II型上皮細胞抑制率比較（%，x±s）

注：對照組比較，*P < 0.01；與過氧化氫組比較，#P < 0.05

2.2 依達拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細胞脂質過氧化物、谷胱甘肽水平的影響

MDA是脂質過氧化的分解產物，是反映組織氧化損傷水平的指標之一。GSH在細胞內能清除過氧化物代謝產物，阻斷脂質過氧化連鎖反應，從而起到保護細胞結構和功能的作用。本實驗提示，過氧化氫處理后，與對照組比較，細胞產生MDA顯著增加，差異有高度統計學意義（P < 0.01），細胞在氧化應激后，細胞損傷程度明顯增加。過氧化氫處理后，與對照組比較，GSH含量顯著下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01），氧化應激可以通過減少谷胱甘肽對細胞的保護作用引起細胞損傷。經依達拉奉處理后，與過氧化氫組相比，MDA含量下降（P < 0.05），GSH含量升高（P < 0.05），提示依達拉奉可以通過增加谷胱甘肽含量，清除過氧化物代謝，從而減少細胞氧化損傷水平。見表2。

表2 各組脂質過氧化物、谷胱甘肽水平比較（x±s，n = 6）

注：與對照組比較，*P < 0.01，與過氧化氫組比較，#P < 0.05；MDA：脂質過氧化物；GSH：谷胱甘肽

2.3 依達拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細胞IL-6、IL-8含量的影響

對照組IL-6、IL-8含量較低，過氧化氫組IL-6、IL-8表達升高，提示氧化應激可以誘導炎癥因子IL-6、IL-8釋放。依達拉奉處理24 h后，可以減少炎癥因子表達，改善氧化應激損傷，炎癥因子IL-6、IL-8含量下降，與過氧化氫組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

表3 依達拉奉對氧化應激后肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌IL-6

和IL-8的影響（ng/L，n = 6，x±s）

注：對照組比較，*P < 0.01；與過氧化氫組比較，#P < 0.05；IL-6：白介素-6；IL-8：白介素-8

2.4 依達拉奉對氧化應激后肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡率的影響

通過流式細胞儀檢測，對照組、過氧化氫組、過氧化氫-依達拉奉組細胞的凋亡率分別為（4.97±0.40）%、（38.88±0.80）%、（14.67±0.50）%，氧化應激對肺泡Ⅱ型上皮細胞產生細胞損傷，細胞凋亡率明顯增加，在依達拉奉處理后，可以減輕細胞膜脂質過氧化連鎖反應和炎性反應，減少細胞損傷，從而減少細胞凋亡。見表4。

表4 依達拉奉對氧化應激后肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡率的影響（%，x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.01；與過氧化氫組比較，#P < 0.05

2.5 依達拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細胞細胞NF-κB蛋白水平的影響

過氧化氫處理建立氧化應激模型后，NF-κB在細胞外刺激下被激活，過氧化氫組肺泡Ⅱ型上皮細胞細胞NF-κB蛋白水平增高，與對照組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。依達拉奉干預后，過氧化氫-依達拉奉組NF-κB蛋白水平與過氧化氫組比較有所下降，差異有統計學意義（P < 0.05），可以抑制炎性反應。見表5。

表5 各組細胞NF-κB蛋白水平的影響（x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.01；與過氧化氫組比較，#P < 0.05

3 討論

目前認為，急性肺損傷是機體過度炎性反應導致肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞廣泛破壞的結果。急性肺損傷時出現的表面活性物質衰竭的共同的病理特點是肺泡的機械性損傷和肺泡Ⅱ型上皮細胞的過度凋亡[5]。

本研究通過氧化應激建立肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡模型，通過MDA及GSH試劑盒檢測MDA、GSH水平，MDA是脂質過氧化的分解產物，是反映組織氧化損傷水平的指標之一。GSH在細胞內能阻斷脂質過氧化連鎖反應，從而起到保護細胞結構和功能的作用。近年來發現細胞凋亡過程中具有還原性GSH耗竭現象，GSH水平與細胞凋亡密切相關。實驗發現過氧化氫處理后，肺泡Ⅱ型上皮細胞GSH含量下降，MDA升高，差異均具有統計學意義。氧化應激損傷誘導了細胞凋亡，細胞生長抑制率增加，細胞凋亡率升高。

NF-κB是一種重要的核內轉錄因子，在細胞炎性反應、免疫反應以及細胞凋亡等過程中起著重要的作用。NF-κB通常處于非激活狀態，當受到細胞外刺激，在IKK酶的激活作用下磷酸化，啟動調節炎癥因子，本研究發現氧化應激可激活NF-κB，誘導產生多種促炎癥細胞因子（如IL-6，TNF-α、IL-1、IL-8等）[6-7]，加重促炎性和抗炎癥細胞因子之間的失衡。

IL-8是中性粒細胞重要的趨化因子，是炎癥性疾病的重要介質，在抗感染、免疫反應調節以及抗腫瘤方面有重要作用。IL-8對特異性和非特異性的免疫細胞具有強烈的趨化作用，其中主要是對嗜中性粒細胞的趨化和激活作用，導致細胞變形反應，釋放溶酶體，形成超氧化物，從而促進炎性反應[8-9]，對淋巴細胞和嗜堿性粒細胞也有趨化作用。IL -6可上調內皮細胞的ICAM-1，并使內皮表達E-選擇素，使中性粒細胞黏附于血管內皮細胞表面，形成小栓子，導致微循環障礙[10-11]，還能促進中性粒細胞氧化反應，從而使中性粒細胞在炎性反應部位數量增多，延緩中性粒細胞的凋亡，超氧陰離子釋放增多，加重炎性反應[12-13]。

本研究通過氧化應激建立肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋亡模型，發現氧化應激誘導細胞凋亡的同時，炎癥因子IL-6、IL-8、NF-κB表達增高，而采用依達拉奉干預后，細胞凋亡減少，IL-6、IL-8、NF-κB表達下降。

由此推測，采用雙氧水對肺泡Ⅱ型上皮細胞進行處理后，氧化應激激活了NF-κB的表達，進而啟動了IL-6、IL-8等炎性因子的表達，從而導致一系列的炎性反應和內皮通透性增高，構成了肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的物質基礎。

而依達拉奉是一種強效的新型羥自由基清除劑，經單電子轉移作用清除自由基，通過自由基中間體轉化，變為穩定的氧化產物[14-15]?？梢詼p輕中性粒細胞浸潤及細胞膜脂質過氧化連鎖反應，抑制脂質自由基生成，促炎細胞因子表達下調[16-17]。

因此依達拉奉干預后，不僅可以通過自由基清除功能減輕氧化應激的作用，減少氧化應激對NF-κB的活化影響，還有可能直接影響NF-κB、IL-6、IL-8的表達抑制炎性反應的影響，減輕凋亡。此外，有研究證實，NF-κB上調可促進部分細胞存活基因和凋亡抑制基因表達，或活化持續性生長信號，從而保護細胞免于調亡[18-19]。本研究顯示，NF-κB下調，IL-6、IL-8表達下調，細胞凋亡減少。提示肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡受炎癥因子的影響更加明顯，而NF-κB下調所致凋亡基因升高在肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡處于次要地位，其具體機制還需要進一步深入研究。

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（收稿日期：2013-11-18 本文編輯：李繼翔）

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（收稿日期：2013-11-18 本文編輯：李繼翔）