研究生細胞電生理實驗課設計與實踐

范 茁，吳振強

（華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006）

理論和實踐相結合一直是現代化高校辦學的宗旨，科學實驗可以驗證理論并加深對理論知識的理解，在高校生物學科的教學中占有舉足輕重的地位［1］。然而目前大多數高校仍然存在教學實驗室設備陳舊，而科研實驗室的大型儀器對教學領域的開放嚴重不足等問題，這就導致了學生理論知識的發展更新速度較快，而實驗課程因為儀器方面的限制跟進不上的現狀［2-3］。例如，在生物學科本科及研究生的教學中，電生理學的知識主要來自于沿用多年的蛙坐骨神經腓腸肌標本的制備及對其神經干動作電位傳導的測量，這是組織水平的電生理現象。細胞水平電生理由于其所依托的膜片鉗實驗系統價格相對昂貴，操作精細、復雜，主要服務于科研領域，一直是高校生物學科實驗教學領域的空缺。本文將根據華南理工大學生物科學與工程學院現有的教學和科研條件，闡述利用膜片鉗技術為生物學科研究生開設細胞電生理學實驗課程的必要性和可行性，并對課程的內容、設置及考核方式進行詳細的探討。

1 為生物學科研究生開設細胞電生理學實驗課程的必要性

細胞電生理是組織及機體電生理現象的基礎，因為難以檢測使之變得更抽象、更難理解。任何一個學科，尤其是生物學科，理論和實驗都是相輔相成、互相促進的，理論指導實驗的順利進行，實驗又反過來驗證理論、使理論知識變得形象易懂。生物學本科生相對粗淺的電生理學知識來自于蟾蜍坐骨神經腓腸肌標本制作及神經干動作電位傳導測量等實驗課程。研究生階段對知識的追求更加深入、細致、透徹，細胞電生理學作為理解其他電生理現象的基石，是生物學科研究生教學的重要內容。然而由于儀器操作復雜、樣品準備時間較長、實驗失敗率高等缺點，細胞電生理的實驗課程在大多數院校生物學科的教學中一直存在空缺。近年來有些院校開始將細胞電生理和膜片鉗技術作為高級生理學課程的一小部分內容，與之配套的實驗課程則由于膜片鉗實驗技術的難度及復雜程度并沒有很好地跟進，這就使得學生對離子通道、動作電位等細胞電生理知識的理解處于死記硬背的層面，停留在似懂非懂的狀態。由此可見，為生物學科研究生開設與理論知識配套的細胞電生理實驗課程非常必要和緊要。

2 為生物學科研究生開設電生理實驗課程的可行性

膜片鉗技術作為研究離子通道的“金標準”，將細胞水平和分子水平的電生理學研究聯系在一起，被人們稱為可以和基因克隆技術并駕齊驅的革命性技術，給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。它自上世紀70年代問世以來，已經發展成為現代細胞電生理學的常規研究方法，廣泛應用于細胞生物學、神經科學、藥理學、病理生理學、心血管科學、中醫藥學等研究領域［4-7］。利用膜片鉗技術可以在細胞水平記錄可興奮細胞的動作電位及不同成分離子電流、記錄單通道及全細胞離子通道電流的動力學特征、研究不同神經元之間的突觸聯系、觀察藥物對特異性離子通道電流的影響［8］。

經過幾十年的發展，膜片鉗技術日趨成熟和完善，研究領域也越來越廣。從只能記錄一個細胞的單探頭放大器發展到可記錄不同神經元之間突觸聯系的雙探頭、甚至三探頭放大器；從獨立的系統發展到可以和鈣成像、肌張力等系統聯用的多功能綜合系統；從耗時耗力的常規手動技術發展到高通量的全自動膜片鉗技術［9-10］。除此之外，系統外圍配件人性化的改進使得膜片鉗操作變得更加簡單和易控，例如微操系統的自動化以及顯微鏡和CCD成像系統結合等方面的改進都大大減輕了操作人員的工作量和工作強度。

膜片鉗技術在上世紀80年代進入中國，經過幾十年的發展，國內有越來越多的專家學者從事電生理領域的研究，培養出一批又一批的優秀人才，他們為膜片鉗電生理實驗課程的開設提供了人力資源保障。如今膜片鉗技術在國內更加普及，越來越多院校的生物學科配置了科研使用的膜片鉗系統。總之，膜片鉗技術的成熟和硬件系統的完善為細胞電生理實驗課程的開設提供了有力的硬件保障。

3 細胞電生理實驗課程的設置和考核方式

膜片鉗電生理是融合了物理學、電子學、生物學等多學科的綜合實驗技術，為生物學科研究生開設的細胞電生理實驗課要適合生物學科的學生物理學、電子學知識相對不足的特點，對膜片鉗技術原理方面的講解要淺顯易懂，側重于生物學應用相關的內容。下面就這一課程的具體設置和考核方式一一闡述。

細胞電生理實驗課包含理論講解和實驗操作2部分內容，理論部分包括：

（1）細胞離子通道的類型，靜息電位的形成機制，可興奮性細胞動作電位的形成機制。

（2）膜片鉗技術的發展、原理和應用。

（3）膜片鉗技術的4種常見的記錄方式。

（4）膜片鉗硬件和軟件的介紹。

重點和詳細地講解第一和第三部分。第二和第四部分講解地點最好在放置膜片鉗的實驗室，對照實物可以使學生更容易理解抽象的內容。實驗部分則主要以急性分離的大鼠心肌細胞為研究對象，觀測大鼠心肌細胞的靜息電位、動作電位和3種主要成分離子電流（Na＋、K＋和 Ca2＋電流）［11-12］。此外將某一種電壓門控性離子通道（例如BK通道）轉染到傳代培養的細胞（CHO或HEK293），可以研究特定種類離子通道單通道和全細胞的特性。

樣品準備，尤其是心肌細胞的急性分離需要的時間較長，且容易失敗，需要由膜片鉗技術人員或者電生理研究室高年級的研究生來完成，但是樣品準備的原理和過程要對學生進行講解，這樣可以使學生更容易理解實驗的結果。實驗操作課程采取觀摩和動手操作相結合的方式進行，簡單且易于掌控的操作可以由學生完成，難度大的操作如封接、破膜等由教師或技術員完成后給學生看一下結果即可。

實驗操作課分4次進行。

第一次課，練習玻璃微電極的拉制和拋光；在顯微鏡下尋找玻璃電極；電極入水接近細胞等一系列操作。此外利用模擬細胞演示檢測全細胞電流的整個操作過程，這一次的實驗主要由學生完成，為以后檢測真實細胞的動作電位及電流打下基礎。

第二次課，檢測大鼠心肌細胞靜息電位、動作電位和動作電流。大鼠心肌細胞要在上課前準備好，上課時先讓學生觀察大鼠心肌細胞的形態，選擇橫紋清楚的細胞進行實驗。本次實驗課難度高的操作要由教師完成，比如心肌細胞的封接和破膜，破膜后可在教師的指導下由學生進行操作。封接、破膜完成后將電壓鉗轉換為電流鉗模式，觀測細胞靜息膜電位，之后給細胞施加約900pA、5ms時長的脈沖電流，檢測細胞的動作電位。動作電流則以之前檢測到的動作電位為鉗制電壓程序，在電壓鉗模式下進行檢測。結合動作電位和動作電流的形狀，給學生講解動作電位形成的離子機制及不同時間段對應的離子電流的方向和成分。

第三次課，檢測心肌細胞3種主要離子電流成分。細胞封接、破膜完成后在電壓鉗模式下檢測電流，先在不加任何阻斷劑的情況下檢測全部成分混合的離子電流，然后用阻斷劑結合脈沖電壓程序分離出Na＋、K＋和Ca2＋3種不同的離子電流成分。實驗完成后，讓學生觀察和記錄3種成分離子電流的特征和幅度。

第四次課，檢測轉染到HEK293細胞上的BK單通道及全細胞電流。HEK293的傳代培養要提前準備好，BK及GFP質粒的共轉染在實驗課的前一天由實驗技術人員完成，讓學生選擇有綠色熒光的細胞進行實驗。和上次一樣，細胞的封接、破膜等難度大的操作由教師完成，其他可以交給學生操作。封接完成后，cell-attach模式記錄BK單通道電流［13］，之后破膜，記錄BK全細胞電流。實驗完成后，讓學生觀察BK單通道和全細胞電流的特征，記錄電流幅度。

課程考核采取動手能力和實驗報告相結合的方式，動手能力主要看學生實驗操作掌握的快慢程度和準確程度、有沒有嚴重的操作錯誤，實驗報告則針對實驗結果圖形、數據及課后思考題的回答等給予評分。

4 總結和討論

本文闡述了為生物學科研究生開設細胞電生理課程的必要性、可行性以及課程具體的設置和考核方式。細胞電生理是生物體可興奮組織電生理現象的基礎，如心肌的搏動、神經的沖動等都是依賴于單個細胞的電生理特性的。依托于膜片鉗技術的電生理實驗課程可以彌補學生在細胞電生理實驗方面的不足，輔助其理解抽象的理論知識。因為膜片鉗技術專業性強、操作復雜，樣品的前期準備也耗時耗力，所以細胞電生理的實驗課程不適合為理論知識和實驗技能相對薄弱的本科生開設，而作為加強型課程為對此領域感興趣的研究生開設則有助于其提高實驗技能、拓展知識面、增強創新能力。

（

）

［1］余玉龍.強化教學學術 促高校教學科研雙贏［J］.中國高等教育，2012（1）：33-34.

［2］高惠玲，何予，李曉林，等.教學和科研一體化共建實驗室的探索［J］.實驗技術與管理，2010，27（9）：181-183.

［3］陳容容，石雪芹，張金紅，等.提高大型儀器的使用效益，提升教學科研整體水平［J］.實驗技術與管理，2011，28（1）：232-235.

［4］林燕飛，歐陽守.膜片鉗技術研究進展及其應用［J］.海峽藥學，2008，20（9）：8-11.

［5］李妙齡，曾曉榮.膜片鉗技術在心血管及藥理學研究中的應用［J］.中國心血管病研究，2007，5（9）：698-700.

［6］韓旭東，王益民，劉顏強，等.膜片鉗技術原理及在中藥研究中的應用［J］.實驗室科學，2011，14（4）：108-112.

［7］唐朝克，楊永宗.膜片鉗技術在動脈粥樣硬化研究中的應用［J］.生命科學研究，2002，6（1）：74-77.

［8］康華光.細胞電生理與膜片鉗技術［J］.中國醫療器械雜志，2000，20（3）：155-160.

［9］沈亞峰，梁文，雷長海，等.利用膜片鉗-激光掃描共聚焦顯微鏡同步實時系統觀察心肌細胞漿內鈣離子的釋放［J］.電子顯微學報，2008，27（2）：127-129.

［10］曹小于，鄭婉云，魯燕濱，等.離子通道研究技術的最新進展：全自動膜片鉗技術［J］.現代儀器，2007（2）：47-50.

［11］Eick R E，Whalley D W，Rasmussen H H.Connections：heart disease，cellular electrophysiology，and ion channels［J］.FASEB J，1992，6（8）：68-80.

［12］Ravens U，Wettwer E，Ohler A，et al.Electrophysiology of ion channels of the heart［J］.Fundam Clin Pharmacol，1996，10（4）：1-8.

［13］Molleman A.Patch Clamping：An Introductory Guide to Patch Clamp Electrophysiology［M］.NJ：Hoboken，Wiley，2002.