葛根總黃酮對利血平致偏頭痛大鼠的保護作用

唐黎明， 石勁敏， 張素慧， 寧 煉， 金若敏， 張 彤*

（1.上海市食品藥品檢驗所藥理毒理室， 上海 201203； 2.上海中醫藥大學， 上海 201203）

葛根總黃酮對利血平致偏頭痛大鼠的保護作用

唐黎明1， 石勁敏1， 張素慧1， 寧 煉1， 金若敏2， 張 彤2*

（1.上海市食品藥品檢驗所藥理毒理室， 上海 201203； 2.上海中醫藥大學， 上海 201203）

目的 研究葛根總黃酮經鼻給藥對利血平致偏頭痛模型動物的主要治療作用及其機制。方法 采用皮下注射利血平制備大鼠偏頭痛模型，實驗設陰性對照組、模型組、麥角胺咖啡因組和葛根總黃酮組。除麥角胺咖啡因組給藥1次外， 其余各組共給藥 3 次， 每次間隔 20min。 各組首次給藥后 60min 取血與腦組織， 觀察給藥后大鼠腦內去甲腎上腺素、 多巴胺、 高香草酸、 5-羥色胺 （5-HT）、 5-羥吲哚乙酸等神經遞質水平的變化及大鼠血液中一氧化氮合酶（NOS） 水平的變化。 結果 模型組動物腦內多巴胺、 5-HT水平顯著降低， 血液中的 NOS 水平明顯升高； 滴鼻給予不同劑量的葛根總黃酮能明顯提高利血平致偏頭痛模型動物腦內去甲腎上腺素、 多巴胺的水平， 大鼠血液中的 NOS水平顯著降低。結論 葛根總黃酮滴鼻給藥能明顯改善利血平致偏頭痛的癥狀。

葛根總黃酮；利血平；偏頭痛；大鼠

葛根為豆科植物野葛 Pueraria lobata （ Willd.）Ohwi的干燥根。 現代研究表明， 葛根可用于解熱和治療偏 頭 痛［1］。 經 鼻 給 藥， 中 醫 稱 為 鼻 療 法。中醫學認為 “鼻為肺之竅，其氣上通于腦，下行于肺”。現代研究表明，藥物經鼻吸收能發揮局部和全身治療作用，并具有一定的腦靶向性。鼻黏膜有豐富的血管淋巴網，故經鼻給藥吸收迅速，可避免肝臟的首過效應，生物利用度高，尤其適用于胃腸道吸收較差的藥物。本實驗擬對新的給藥途徑——葛根總黃酮滴鼻對葛根抗利血平致大鼠偏頭痛作用進行研究，在前期實驗中已對硝酸甘油致偏頭痛模型進行了研究，發現葛根總黃酮滴鼻給藥能明顯改善硝酸甘油致偏頭痛的癥狀。根據偏頭痛的發病機理，選取利血平致偏頭痛病理模型，觀察總黃酮化合物滴鼻給藥是否對這種病理模型有效，從而為開發新的治療偏頭痛藥物及葛根新的給藥途徑提供更多的實驗依據。

1 材料與動物

1.1 試劑與儀器 葛根總黃酮， 自制， 總黃酮純度大于 78.3%，葛根素大于 30%，批號為 070511。麥角胺咖啡因片 （ Ergotamine Caffeine）， 上海醫藥（集團） 有限公司信誼制藥總廠生產， 批號為060401。 利血平 （ 原料）， 海南制藥廠生產， 批號： 070201。 去甲腎上腺素對照品、 鹽酸多巴胺對照品、 2，3-二羥基苯甲酸 （DHBA） 對照品和 5-羥色胺 （5-HT） 均為 Fluka產品。 高香草酸 （ HVA）和 5-羥吲哚乙酸 （5-HIAA） 均為 Sigma產品； 甲醇為色譜純， 德國 Merck 產品。 辛烷磺酸鈉為日本東京化成產品。 EDTA-Na2、 磷酸氫二鈉、 檸檬酸、氯化鈉、 高氯酸均為分析純試劑。 水為 Millipore超純水。葛根總黃酮溶液：稱取供試品，加適量純化水后超聲溶解并稀釋至質量濃度為 78、 156、 235 mg/mL的溶液， 用于滴鼻給藥。 麥角胺咖啡因溶液： 臨用時以純化水配成 0.2 mg/mL。

液相色譜儀 （ Waters2695 型-2465 型電化學檢測器， 配 有 Empower數 據 處 理 系 統）。 Shimatzu UV2100 紫外分光光度計、 FLUKO F6/10 高剪切分散乳化機、 Sigma公司 3K30 型高速 離心機、 Hettich ROTANTA 460R高速冷凍離心機等。

1.2 動物 SD大鼠， 雌雄皆用， 體質量 230 g～250 g， 由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，生產許可證號 SCXK （滬） 2007-0005。 動物飼養房間的環境及光照周期條件為溫度 19 ～23 ℃，相對濕度 40% ～70%， 光照周期 12 h 明/12 h 暗， 氨濃度范圍≤14 mg/m3。

2 方法

2.1 模型及分組 取大鼠， 隨機分為 6 組， 分別為陰性對照組、模型組、麥角胺咖啡因組、葛根總黃酮滴鼻給藥低、中、高劑量組。除陰性對照組外， 其余各組大鼠利血平皮下注射 40 mg/kg造模。各組均在造模后第4日給藥。麥角胺咖啡因組一次口服灌胃麥角胺咖啡因 2 mg/kg。陰性對照組、模型組和葛根總黃酮組均給藥 3次，每次間隔20 min。 陰性對照組和模型組均滴鼻給予 40 μL/只的純化水；葛根總黃酮組分別滴鼻給予 78、 156、235 mg/mL的葛根總黃酮， 給藥體積 40 μL/只，給藥總劑量為 3 次給藥總量， 分別為 37、 75 和113 mg/kg。 一部分大鼠麻醉取血， 另一部分大鼠取腦組織。陰性對照組、模型組和葛根總黃酮組動物于首次給藥后 60 min， 麥角胺咖啡因組于給藥后60 min 腹腔注射 1 mg/kg烏來糖麻醉， 腹主動脈取血，置離心管中，置4℃冰箱中保存。1 h后，4 000 r/min， 4 ℃離心 15 min，取上清， 用于一氧化氮合酶 （NOS）測定。 給藥后 60 min 將大鼠處死置于冰臺上，快速取出大鼠腦組織，濾紙吸干組織表面的水分和血液，稱定質量，記錄，鋁箔紙包裹于液氮保存。用于神經遞質的測定。

2.2 指標檢測

2.2.1 神經遞質測定 樣品處理： 測定時取腦組織加 10 倍質量蛋白沉淀液 （0.1 mol/L高氯酸溶液含EDTA-Na20.01 mmol/L）， 勻漿。取 1 mL腦組織勻漿，加 100 μL內標溶液 （DHBA溶液 1 μg/mL），30 000 r/min 離心 30 min， 分取上清液 50 μL， 進樣分析。 測試條件： Agilent Zorbax Bonus-RP C18色譜柱 （150 mm ×4.6 mm，5 μm）； 流 動 相 為 80 mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液 （內含辛烷磺酸鈉 0.05 mmol/L， EDTA-Na20.22 mmol/L， 檸 檬 酸 58 mmol/L和氯化鈉 5 mmol/L， pH調節至 4.3） -甲醇 （95 ∶5， v/v）； 體積流量為 1.0mL/min； 進樣量為 50 μL；柱溫 30 ℃； 工作電壓 +1.00 mV。 檢測參數： 測定去甲腎上腺素、 多巴胺、 高香草酸、5-羥色胺 （5-HT）、 5-羥吲哚乙酸 （5-HIAA） 水平。由于腦組織本身含有以上各種神經遞質，無法取得空白腦組織作為基質進行方法學研究，且實驗結果采用組間比較，因此可不必測得遞質水平的絕對值，而直接用峰面積之比 A遞質/A內標進行比較。

2.2.2 NOS 測定 取血清， 硝酸還原酶法測定血液中 NOS水平。步驟按試劑盒說明書操作， 測得各樣本吸光度值， 計算 NOS水平。

2.3 數據處理 數據采用 SPSS 10.0 統計軟件進行分析。

3 結果

3.1 腦組織勻漿中神經遞質和內標 DHBA的典型色譜圖見圖1。

圖1 測定腦組織勻漿中神經遞質和內標 DHBA的典型色譜圖Fig.1 TyPical chromatogram of neurotransim itter and internal standard in blood tissue homogenate

3.2 對利血平致偏頭痛模型大鼠腦內神經遞質的影響 與陰性對照組相比，模型組動物的多巴胺、5-HT水平顯著降低 （P＜0.01）； 麥角胺咖啡因組可明顯提高模型動物腦內多巴胺 （P＜0.05）； 不同劑量的葛根總黃酮組均能明顯提高模型動物腦內去甲腎上 腺 素、 多 巴 胺 和 5-HIAA的 水 平 （P＜0.05 或 P＜0.01）。 見表 1。

3.3 對利血平致偏頭痛模型大鼠血液內 NOS 的影響 與陰性對照組相比，模型組動物血液內的NOS水平明顯升高， 給予陽性對照或藥物后， NOS水平顯著降低，與模型組相比差異具有統計學意義（P＜0.01）。 見表 2。

4 討論

葛根為豆科植物野葛 Pueraria lobata （Willd.）Ohwi的干燥根， 有解肌， 退熱， 生津， 透疹， 升陽，止瀉等功能。古代多用于外感發熱頭痛、項強、口渴、消渴、麻疹不透、熱痢、泄瀉等癥?，F代研究表明，葛根中的黃酮類化合物為其主要化學成分，臨床應用廣泛，尤以葛根素為著，葛根對正常和高血壓動物均有一定的降壓作用，靜脈注射葛根浸膏、總黃酮、葛根素及其脂溶性部分和水溶性部分均能使正常麻醉犬的血壓短暫而明顯的降低，口服葛根水煎液或醇浸膏對高血壓犬也有一定的降壓作用。 在臨床上， 對50例高血壓病患者靜注葛根素再次證實其有降壓作用。經鼻給藥系統的研究是目前藥學研究的一個熱點，藥物經鼻給藥起效快， 副作用小， 故本實驗對新的葛根制劑——葛根總黃酮滴鼻劑抗利血平致大鼠偏頭痛的作用及機制進行了研究。

表1 葛根總黃酮對利血平致偏頭痛模型大鼠腦內神經遞質的影響 （）Tab.1 Effect of total flavone from pueraria on neurotransm itters in brain of m igraine rats induced by reserPine（）

表1 葛根總黃酮對利血平致偏頭痛模型大鼠腦內神經遞質的影響 （）Tab.1 Effect of total flavone from pueraria on neurotransm itters in brain of m igraine rats induced by reserPine（）

注：與模型組比較，*P＜0.05；**P＜0.01

組 別 劑 量 /（mg·kg-1） 動物 數 /只 去 甲腎 上腺素 多巴 胺 高 香草 酸 5-HT 5-HIAA陰性對照組 / 8 2.03 ±0.45 0.76 ±0.07** 0.015 ±0.003 0.59 ±0.07** 0.20 ±0.02模型組 / 10 1.84 ±0.66 0.52 ±0.09 0.016 ±0.004 0.21 ±0.06 0.22 ±0.04麥角胺咖啡因組 2 8 2.59 ±0.93 0.65 ±0.13* 0.021 ±0.006 0.29 ±0.07 0.27 ±0.04葛根總黃酮組 37 8 3.11 ±0.77* 0.66 ±0.07* 0.027 ±0.014 0.26 ±0.05 0.30 ±0.04**75 8 3.16 ±0.82** 0.68 ±0.05** 0.023 ±0.010 0.26 ±0.05 0.25 ±0.02 113 7 2.74 ±0.73 0.77 ±0.08** 0.018 ±0.009 0.26 ±0.05 0.29 ±0.05*

表2 葛根總黃酮對利血平致偏頭痛模型大鼠血液內 NOS的影響 （）Tab.2 Effect of total flavone from pueraria on NOS in blood ofm igraine rats induced by reserPine（）

表2 葛根總黃酮對利血平致偏頭痛模型大鼠血液內 NOS的影響 （）Tab.2 Effect of total flavone from pueraria on NOS in blood ofm igraine rats induced by reserPine（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

NOS /（U·mL-1）陰性 對照 組 / 12 23.888 0 ±1.945 6**模型 組 / 12 27.662 1 ±2.398 9麥角 胺咖 啡因組 2 12 21.467 1 ±3.278 4**葛根 總黃 酮組 37 12 22.336 6 ±0.829 2**75 12 24.976 9 ±1.884 5*113 12 23.379 5 ±0.993 6組 別 劑量/（ mg·kg-1）動物數/只**

利用利血平注射液注射小鼠可產生偏頭痛模型［2］。 利血平可用于高血壓危象和精神病性躁狂癥狀。它是一種腎上腺素能神經元阻斷性抗高血壓藥。一方面使周圍交感神經末段去甲腎上腺素貯存耗竭，使交感神經沖動的傳導受阻，從而擴張血管、降低周圍血管阻力發揮降壓作用。另一方面，也使腦、 心和其他器官中的兒茶酚胺和 5-羥色胺貯存耗竭，而使心率減慢，心排血量減少產生降壓作用。因此，利血平化偏頭痛小鼠模型是一種常用的模型，具有簡便、經濟、易得的特點。

本研究中所用制劑為滴鼻劑，由于小鼠鼻腔太小，給藥量無法加大，因此，首次嘗試采用利血平化偏頭痛大鼠模型， 觀察對兒茶酚胺和 5-羥色胺類神經遞質的影響。造模后觀察到大鼠出現明顯活動減少，動物攝食減少，體質量增長緩慢，皮溫下降等一系列體征變化。同時實驗結果顯示模型組動物腦組織內的多巴胺、5-羥色胺水平顯著降低，與陰性對照組相比有非常顯著的差異；去甲腎上腺素水平雖無顯著性差異，但也呈下降趨勢，表明模型是成功的。這與文獻報道利血平化偏頭痛小鼠模型的體征變化和神經遞質變化是一致的［3-10］。 麥角胺咖啡因可明顯提高模型動物腦內多巴胺水平，對5-羥色胺、 去甲腎上腺素和高香草酸都有升高的趨勢。不同劑量的葛根總黃酮能明顯提高模型動物腦內多巴胺、去甲腎上腺素和高香草酸的水平，與模型組相比均有顯著性差異。 對 5-羥色胺也有升高的作用趨勢。

一氧化氮 （NO） 是一種血管內皮舒張因子（EDRF）， 在偏頭痛和其他頭痛產生機制中是一個十分關鍵的因子。偏頭痛與其擴血管作用有關［11-15］。 NO不但激發偏頭痛， 而且對保持 偏頭痛持續狀態非常重要。研究證實偏頭痛患者發作期頸靜脈血漿中及腦脊液中 NO水平明顯升高。由于NO在偏頭痛和其他頭痛產生中是一個十分關鍵的因子， 而內源性 NO的合成是在 NOS的參與下合成的， 因此研究 NOS的水平顯得尤為重要。 在本實驗室的研究中，表明葛根總黃酮滴鼻給藥后可以明顯降低硝酸甘油致偏頭痛大鼠體內血清及腦組織中一氧化氮合酶的水平。本次研究結果表明，利血平化偏頭痛大鼠模型組一氧化氮合酶的水平明顯上升，與陰性對照比較有非常顯著的差異，麥角胺咖啡因可以明顯降低一氧化氮合酶的水平，葛根總黃酮各劑量組滴鼻給藥后也可以明顯降低一氧化氮合酶的水平，與模型組相比均有顯著性差異，表明葛根總黃酮在治療利血平化偏頭痛大鼠中降低血液中一氧化氮合酶的水平，減少一氧化氮的合成，是緩解偏頭痛癥狀的機制之一。

［ 1］ 侯家玉.中藥藥理學［M］.北京： 中國中醫藥出版社，2006： 33-35.

［2］ 杜力軍，孫 虹，李 敏，等.精制吳茱萸膠囊對偏頭痛小鼠的作用［J］.中藥藥理與臨床， 1998， 14（5）： 5-7.

［3］ 呂金勝，高全杰，封永勇，等.復方天麻口服液對偏頭痛小鼠的作用［ J］ .醫學導報， 2004， 23（3） ： 137-139.

［4］ 張雙全，馬仁強，蘇志源，等.偏痛寧片的主要藥效學實驗研究［J］.中國實驗方劑學雜志， 2009， 15（5）： 71-73.

［5］ 向紹杰，劉 冉，孟 莉，等.清空分散片對利血平所致小鼠偏頭痛模型的影響［J］.實驗動物科學， 2010， 27（5）：13-15.

［6］ 蔣鳳琴，馮敬文，沈雪梅.兩種工藝制備的中藥提取液抗偏頭痛作用的實驗研究［J］.中國醫藥導刊， 2010， 12（3）： 454-456.

［7］ 秦旭華， 李祖倫， 金沈銳.白芷總香豆素對偏頭痛模型小鼠 5-HT和 MAO的影 響 ［ J］.時珍 國醫 國藥， 2012， 23（9）： 2190-2191.

［8］ 樓招歡，黃月芳，呂圭源，等.天麻鉤藤顆粒對利血平致偏頭痛模型小 鼠的影響 ［ J］.中 華中醫藥雜 志， 2012， 27（5）： 1412-1415.

［9］ 吳燕川，潘學強，龔慕辛，等.吳茱萸湯對虛寒型偏頭痛小鼠單胺類神經遞質及一氧化氮含量的調控作用［J］.中醫學報， 2012， 27（11）： 1438-1442.

［10］ 劉頂鼎， 郭建生， 曾貴榮， 等.芎麻湯及其提取物對利血平低 5-HT型偏頭痛模型小鼠的影響［J］.湖南中醫藥大學學報， 2012， 32（3）： 17-19.

［11］ Thomsen L L， Olesen J.Nitric oxide theory of migraine［ J］ . Clin Neurosci， 1998， 5（1） ： 28-33.

［12］ Stephen A， Chalimoniuk M.Level of nitric oxide-dependent cCMP in patients with migraine［ J］ .Cephalalgia， 1998， 18（9）： 631-634.

［13］ Marteuetti P， Alos D， Stirparo G.Modulation of nitric oxide synthase by nitric oxide donor compounds inmigraine［ J］.Int J Chin Res， 1998， 28（2） ： 135-137.

［14］ 連亞軍， 滕軍放， 王友生， 等.偏頭痛患者血漿一氧化氮和降鈣素基因相關肽含量測定及發病機制探討［J］.中華神經病雜志， 1999， 32（2）： 94-95.

［15］ 逯振宇， 邱德文， 許建陽， 等.萸冰制劑對實驗性偏頭痛大鼠血清 NO/NOS 含量的影響［ J］.遼寧中醫藥大學學報，2011， 13（1）： 195-197.

Protective effect of total flavone from pueraria by nasal drug delivery on reser-Pine-inducingm igraine rats

TANG Li-ming1， SHI Jing-min1， ZHANG Su-hui1， NING Lian1， JIN Ruo-min2， ZHANG Tong2*
（1.Shanghai Institute for Food and Drug Control， shanhai 201203， China； 2.Shanghai University of TCM， Shanghai201203， China）

AIM To observe the protective effectand mechanism of total flavone from Pueraria by nasal drug delivery on reserpine-inducingmigraine rats.METHODS The subcutaneous injection of reserpinewas performed on rat tomake themodel formigraine.Ratswere divided into negative control group， model group， ergotamine caffeine group and three total flavone from Pueraria groups.Rats of ergotamine caffeine group were treated by a single oral gavage.Rats of other groupswere treated three times atan interval of twentyminutes.Rats of negative control ormodel group were treated with water of equal volume.Blood and brains of ratswere collected in sixtyminutes after first administration.The effect of total flavone from Pueraria was observed on noradrenalin， dopamine， 5-hydroxytryptamine（5-HT） ， homovanillic acid， 5-hydroxyindole acetic acid in brain and nitric oxide synthase in blood.RESULTS The levels of dopamine， 5-HT in brain ofmigraine rats induced by reserpine significantly decreased， but the level of nitric oxide synthase（ NOS） in blood significantly increased.The levels of noradrenalin，dopamine in brain ofmigraine rats induced by reserpine significantly increased after treatmentwith different dosage total flavone from Pueraria compared withmodelgroup.The level of NOS in blood reduced significantly in total flavone from Pueraria group and ergotamine caffeine group.CONCLUSION Total flavone from Pueraria could reduce the symptoms ofmigraine induced by reserpine in rats.

total flavone from Pueraria； reserpine， migraine； rat

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0018-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.005

2013-02-12

上海市人才發展基金 （20111015）； 上海市創新團隊及重點學科項目 （J50302）

唐黎明 （1964—） ， 男， 碩士， 主 任藥 師， 研究方 向： 藥理 毒理。 Tel： （ 021 ） 38839900-26111， E-mail： tangliming@smda. gov.cn

*通信作者： 張 彤 （1972—） ， 男， 博士， 教授。 Tel：（021）51322318， E-mail： zhangtdmj@yahoo.com.cn