黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究

羅蘊(yùn)齡 陳宜方 何東元 陳建國

●論 著

黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究

羅蘊(yùn)齡 陳宜方 何東元 陳建國

目的 探討黃芪甲苷（AS-IV）對糖尿病腎病（DN）大鼠足細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制，為DN早期防治開辟一條新途徑。方法 體重180～200g健康雄性SD大鼠45只按配伍法分為正常對照組（NC組）、DN組和AS-IV治療組（DN+AS-IV組），鏈脲佐菌素腹腔注射建立大鼠早期DN模型。DN+AS-IV組大鼠在造模前2周予AS-IV10mg/（kg·d）灌胃預(yù)處理至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共14周。造模后第6、12周末收集并測定24h尿量及尿蛋白；同時(shí)各組按抽簽法選取5只大鼠測體重，處死大鼠后測血生化指標(biāo)，取腎組織，光鏡觀察腎臟病理病理變化，電鏡觀察足細(xì)胞形態(tài)變化，腎母細(xì)胞瘤抑制基因1（WT1）免疫組織化學(xué)染色觀察腎小球足細(xì)胞密度變化，Western blot法測定大鼠腎皮質(zhì)α3β1整合素蛋白水平的變化。 結(jié)果 與NC組相比，DN組大鼠血糖和24h尿蛋白增高，腎臟腎小球系膜區(qū)增生，足細(xì)胞足突融合，腎小球足細(xì)胞數(shù)量減少，α3β1整合素蛋白水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AS-IV可顯著改善DN大鼠蛋白尿，抑制腎小球系膜區(qū)增生，抑制足細(xì)胞足突融合和數(shù)目減少，上調(diào)α3β1整合素表達(dá)。 結(jié)論 AS-IV對早期DN大鼠足細(xì)胞具有保護(hù)作用，可能與其上調(diào)足細(xì)胞α3β1整合素表達(dá)相關(guān)。

黃芪甲苷 糖尿病腎病 足細(xì)胞 α3β1整合素

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是全球范圍內(nèi)危害人類健康的重要疾病之一，其流行趨勢日益嚴(yán)峻。在歐美等發(fā)達(dá)國家，糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是導(dǎo)致CKD的首位疾病。我國成年人CKD患病率為10.8%[1]，隨著社會(huì)老齡化程度的加重、生活水平的改善，在北京、上海等大城市及經(jīng)濟(jì)水平較發(fā)達(dá)的農(nóng)村地區(qū)，DN已逐步超越慢性腎小球腎炎成為導(dǎo)致CKD的首要病因[1]。有研究顯示，足細(xì)胞損傷在DN的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[2]。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成成分，通過α3β1整合素與基底膜連接[3]。足細(xì)胞損傷后可出現(xiàn)足細(xì)胞足突融合，足細(xì)胞從基底膜脫落、凋亡甚至死亡。足細(xì)胞功能障礙或數(shù)量減少可直接導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。但目前尚無針對足細(xì)胞脫落的特異性藥物，主要為對癥治療。黃芪益氣健脾，利水消腫，是臨床治療DN的常用中藥之一，但其治療機(jī)制不明。黃芪甲苷（AS-IV）為黃芪主要活性成分之一，前期研究顯示：AS-IV可改善高糖刺激下足細(xì)胞黏附功能紊亂，其改善作用部分歸因于α3β1整合素的上調(diào)[4]。但上述研究對象為體外培養(yǎng)足細(xì)胞，現(xiàn)進(jìn)一步探討AS-IV對活體DN早期大鼠足細(xì)胞是否同樣具有上述保護(hù)作用，為其應(yīng)用于臨床早期防治DN提供可能。

1 材料和方法

1.1 材料 體重180~200g健康雄性SD大鼠45只（購自上海復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），均飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。按配伍分組法分為正常對照組（NC組）、糖尿病腎病組（DN組）和AS-IV治療組（DN+AS-IV組），各15只。

1.2 方法 按65mg/kg體重一次性腹腔注射溶于pH 4.2、0.1mol/L檸檬酸沖液中的鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）建立糖尿病模型。STZ注射72h后空腹血糖＞16.67mmol/L且于2周后尿白蛋白/肌酐比值＞30μg/mg者認(rèn)為DN造模成功。AS-IV用1%羧甲基纖維素（CMC）配置。DN+AS-IV組在造模前2周予ASIV 10mg/（kg·d）灌胃預(yù)處理直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共14周。NC組及DN組給予等量1%CMC混懸液。

1.3 一般生化項(xiàng)目檢查 在DN造模成功后6、12周末代謝籠中收集各組大鼠的24h尿標(biāo)本，計(jì)算尿量，檢測尿蛋白。分別于第6、12周末采用抽簽法選取5只大鼠測量體重，水合氯醛麻醉后心臟取血，血糖儀（羅氏公司）檢測血糖，自動(dòng)生化分析儀（美國Technicon公司）檢測血肌酐、血尿素氮、血谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶。

1.4 光鏡及電鏡病理檢查 摘除雙側(cè)腎臟，多余組織液氮速凍后置于-80℃保存。

1.4.1 光鏡檢查 腎組織中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，分別行HE、PAS、PASM及Masson染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.2 電鏡檢查 腎皮質(zhì)組織切成1mm×1mm×1mm，用2%戊二醛固定，常規(guī)透射電鏡制樣，超薄切片。觀察足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

1.5 大鼠腎小球腎母細(xì)胞瘤抑制基因1（WT1）表達(dá) 采用免疫組化檢測。WT1小鼠抗大鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，GTVision III抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒購自丹麥Dako公司。按試劑盒說明書操作。每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行拍照，Image pro plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件計(jì)算測量圖片中腎小球總面積及其內(nèi)WT1陽性細(xì)胞所占面積，計(jì)算各腎小球WT1陽性細(xì)胞所占面積比，計(jì)算足細(xì)胞密度，取其平均值記錄。

1.6 腎臟α3β1整合素的表達(dá) 采用Western blot法檢測。細(xì)胞及組織總蛋白抽提試劑盒（KangChen KC-415）提取腎臟組織蛋白。BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（KangChen KC-430）檢測組織蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離，100V電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶室溫內(nèi)封閉60min，加一抗（購自美國Santa Gruz，稀釋比例1∶1 000）于4℃過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（上海康成生物工程公司，稀釋比例1∶5 000）室溫孵育60min，KCTM化學(xué)發(fā)光試劑盒（KangChenKC-420）顯影，在X線片上曝光顯影、定影、沖洗涼干，Bio-Rad2000凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶的光密度，Image J軟件進(jìn)行吸光度分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次，計(jì)算統(tǒng)計(jì)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠一般生化指標(biāo)結(jié)果的比較 STZ注射后第12周末，DN組、DN+AS-IV組大鼠體重較NC組明顯減輕，血糖、尿量及尿素氮均明顯升高（均P＜0.05）。DN組體重、血糖、尿素氮、肌酐及谷丙/谷草轉(zhuǎn)氨酶與DN+AS-IV組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），表明AS-IV對大鼠肝腎功能無不良反應(yīng)，詳見表1。

表1 3組大鼠一般生化指標(biāo)結(jié)果的比較

2.2 3組大鼠24h尿蛋白水平的比較 STZ注射后第6周末DN組大鼠24h尿蛋白水平[（1 630±325）mg/24h]較NC組大鼠[（320±41）mg/24h]顯著升高，STZ注射后第12周末24h尿蛋白水平進(jìn)一步上升為（2 455±794）mg/ 24h。STZ注射后第6周末DN+AS-IV組大鼠24h蛋白尿水平為（1 053±257）mg/24h，明顯低于DN組，第12周末為（1 104±498）mg/24h，下降趨勢更為明顯，詳見圖1。

2.3 腎組織光鏡及電鏡檢查結(jié)果 DN腎組織的光鏡下病理改變主要為腎小球系膜增生，系膜區(qū)寬度超過毛細(xì)血管直徑，系膜區(qū)內(nèi)系膜細(xì)胞超過2個(gè)。STZ注射后第6周末（圖2，見插頁）及第12周末（圖3，見插頁），光鏡可見DN大鼠腎小球輕度系膜細(xì)胞增生，部分毛細(xì)血管管腔壓迫，腎小管水腫；DN+AS-IV組該病理改變得到顯著改善，系膜區(qū)系膜細(xì)胞不超過3個(gè)，毛細(xì)血管腔開放良好。第12周末電鏡可見DN組大鼠腎小球足細(xì)胞足突廣泛融合消失，DN+AS-IV組抑制足細(xì)胞足突融合改善（圖4）。

2.4 大鼠腎小球WT1表達(dá) STZ注射后第12周末，DN組足細(xì)胞密度較NC組明顯下降，DN+AS-IV組較DN組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），詳見圖5、6。

圖1 STZ注射后第6、12周末各組24h尿蛋白（A：6周末；B：12周末；與NC組比較，*P＜0.05；與DN組比較，△P＜0.05）

圖2 3組腎組織STZ注射后第6周末光鏡病理改變（×100）

圖3 3組腎組織STZ注射后第12周末光鏡病理改變（×100）

圖4 3組腎組織STZ注射后第12周末電鏡病理改變（×8 000）

圖5 STZ注射后第12周末腎組織WT1免疫組化

圖6 STZ注射后第12周末腎組織足細(xì)胞密度柱狀圖（與NC組比較，*P＜0.05；與DN組比較，△P＜0.05）

2.5 腎臟α3β1整合素的表達(dá) 與NC組比較，STZ注射第6周和第12周DN組α3β1整合素表達(dá)水平顯著下降，AS-IV治療可抑制α3β1整合素表達(dá)水平的降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），詳見圖7、8。

3 討論

DN是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一[5]。在美國及其他許多發(fā)達(dá)國家，DN是導(dǎo)致終末期腎臟病的首要病因[6-7]。DN早期表現(xiàn)為微量蛋白尿（＞300mg/24h），晚期有腎小球?yàn)V過率的下降、動(dòng)脈血壓的升高以及相關(guān)的心血管并發(fā)癥[8]。其腎臟的病理改變主要表現(xiàn)為：腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)擴(kuò)張以及腎間質(zhì)增生。本研究中成功造模DN大鼠模型，發(fā)現(xiàn)造模后第6周末DN組大鼠24h尿蛋白較NC組大鼠顯著升高，造模后第12周末24h尿蛋白量進(jìn)一步上升。DN+AS-IV組大鼠24h蛋白尿水平在STZ注射后第6周末即較DN組下降,第12周末該下降趨勢更為明顯。光鏡病理顯示，STZ注射后第6周末及第12周末，DN大鼠腎小球輕度系膜細(xì)胞增生，部分毛細(xì)血管管腔壓迫，腎小管水腫。而DN+ASIV組該病理改變得到顯著改善，系膜區(qū)系膜細(xì)胞不超過3個(gè)，毛細(xì)血管腔開放良好，說明AS-IV可部分改善DN的腎臟病理改變。

圖7 STZ注射第6、12周末各組α3β1整合素的表達(dá)

圖8 STZ注射第6、12周末各組α3β1整合素表達(dá)水平柱狀圖（A、B：STZ注射第6周末、12周末α3整合素表達(dá)水平；C、D：STZ注射第6周末、12周末β1整合素表達(dá)水平；與NC組對比，*P＜0.05；與DN組對比，△P＜0.05）

在大部分蛋白尿的疾病中，足細(xì)胞損傷和（或）足細(xì)胞數(shù)量的減少在蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[9]。足細(xì)胞損傷表現(xiàn)為足突融合、消失。隨著疾病的進(jìn)展，足細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)目較少[10]。足細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，幾乎沒有增殖能力，足細(xì)胞脫落將導(dǎo)致不可逆的足細(xì)胞丟失。研究顯示，糖尿病患者血糖升高1個(gè)月后即有足細(xì)胞從腎小球基底膜脫落[11]，并可見足細(xì)胞數(shù)目和（或）密度的減少[12]。WT1為一種與泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)的基因，在腎臟發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)，出生后僅在足細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，對足細(xì)胞功能的維持起重要作用，是成熟足細(xì)胞的特異性標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測WT1在足細(xì)胞中表達(dá)情況，反映足細(xì)胞數(shù)目的改變，以便于觀測足細(xì)胞數(shù)目變化，并提高檢測足細(xì)胞數(shù)目的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)中，造模后第12周末電鏡下可觀測到DN大鼠足細(xì)胞足突融合、消失，WT1染色提示足細(xì)胞密度較正常組明顯減少，經(jīng)AS-IV治療，足細(xì)胞足突融合現(xiàn)象改善，丟失顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

多項(xiàng)研究顯示，黏附分子α3β1整合素水平的改變導(dǎo)致的足細(xì)胞與GBM之間黏附功能的改變是足細(xì)胞脫落的重要原因[13-15]，α3β1整合素是足細(xì)胞上唯一的β類整合素，參與維持足細(xì)胞的正常形態(tài)及GBM的通透性，對足細(xì)胞與GBM的結(jié)合起著關(guān)鍵性作用。α整合素基因敲除小鼠出生時(shí)即出現(xiàn)GBM發(fā)育不成熟、足突消失及大量蛋白尿[16]。β整合素特異性抗體或β整合素阻斷劑均可誘導(dǎo)足突融合、足突與GBM分離及蛋白尿的發(fā)生[17]。DN早期患者及STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠足細(xì)胞α3β1整合素的表達(dá)明顯降低[18]。本實(shí)驗(yàn)中，STZ誘導(dǎo)的DN大鼠α3β1整合素表達(dá)明顯降低，而DN+AS-IV組α3β1整合素表達(dá)和足細(xì)胞密度較DN組顯著升高。結(jié)合24h尿蛋白及病理結(jié)果，提示AS-IV可能通過上調(diào)α3β1整合素表達(dá)，減少足細(xì)胞從GBM脫落，從而延緩蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展。同時(shí)，血生化檢測顯示AS-IV對大鼠的血糖、血尿素氮、血肌酐及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶無明顯影響，提示AS-IV在保護(hù)足細(xì)胞的同時(shí)對大鼠肝腎功能無明顯不良反應(yīng)，為安全、有效的藥物，且其保護(hù)作用與血糖水平無相關(guān)。

綜上所述，AS-IV可以增強(qiáng)足細(xì)胞與GBM黏附的能力，改善足細(xì)胞足突融合及蛋白尿，機(jī)制可能與其上調(diào)α3β1整合素表達(dá)水平有關(guān)，為應(yīng)用于DN早期防治提供可能。

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Effect of astragaloside IV on diabetic nephropathy rat podocytes and its mechanism

LUO Yunling，CHEN Yifang,HE Dongyuan,et al.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Astragaloside IV Diabetic nephropathy Podocyte α3β1Integrin

2013-12-09）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

衛(wèi)生部科研基金資助項(xiàng)目（WKJ2009-2-017）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科（羅蘊(yùn)齡）；浙江醫(yī)院腎內(nèi)科（陳宜方、何東元）；溫州醫(yī)科大學(xué)（陳建國）

陳建國，E-mail：doctor_chen@126.com

【 Abstract】 Objective To investigate the protect effects of astragaloside IV(AS-IV)on diabetic nephropathy rat podocytes and explore its mechanism. Methods Healthy male Sprague-Dawley(SD)rats of 180～200g were randomly divided into normal control group(NC),diabetic nephropathy group(DN)and diabetic nephropathy with AS-IV treatment group(DN+AS-IV).DN was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin.AS-IV treatment was started 2 weeks before STZ injection and lasted 14 weeks.24 hour urine were collected and 24 hour urinary protein were measured at the end of the 6th，12th week after STZ injection.At the end of 6th and 12th week after STZ injection,rats were sacrificed and the blood samples were collected for measuring biochemical parameters.The kidneys were harvested for histopathology,immunohistochemistry,electron microscopy and Western blot examinations,and the renal pathology,morphological changes of podocytes,podocyte density changes and expression of α3β1integrin protein were analyzed. Results In STZ-induced DN rats severe hyperglycemia and proteinuria were developed.Mesangial expansion,increased podocyte loss and decreased integrin α3and β1expression were detected in DN rats. Treatment with AS-IV10mg/(kg·d)for 14 weeks ameliorated proteinuria and podocyte foot process effacement,attenuated the loss of podocytes in glomerules and up-regulated the expression of integrin α3and β1in podocytes. Conclusion AS-IV may protect podocyte and ameliorate diabetic nephropathy by restoring the expression of α3β1integrin in diabetic rats.