槲皮素對人肺癌細胞株A-549細胞增殖的抑制作用

徐曉　劉進　張珂

槲皮素對人肺癌細胞株A-549細胞增殖的抑制作用

徐曉劉進張珂

【摘要】目的觀察槲皮素對人肺癌細胞株A-549細胞增殖和凋亡的影響。 方法以不同濃度槲皮素培養人肺腺癌細胞株A-549細胞后，采用MTT法檢測槲皮素對細胞增殖的影響；流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡變化；通過倒置顯微鏡、Heochst33258熒光染色、透射電鏡觀察凋亡細胞的形態學改變；Western blot方法檢測凋亡抑制蛋白Survivin的表達情況。 結果不同濃度槲皮素作用于人肺腺癌細胞株A-549細胞24h后，細胞存活率顯著降低，且與劑量呈依賴關系。15、30、60μmol/L的槲皮素作用于人肺腺癌細胞株A-549細胞24h后，細胞阻滯發生在G2/M期；凋亡率分別為（7.24±1.73）%、（12.57±2.7）%和（26.02± 1.67）%，與濃度為0的凋亡率[（2.67±2.32）%]比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；從形態學上觀察到肺癌細胞發生凋亡或壞死。通過Western blot檢測發現，隨著槲皮素作用濃度的增加Survivin蛋白的表達逐漸降低。 結論槲皮素對人肺癌細胞株A-549細胞株有抑制其增殖及誘導凋亡的作用，其機制可能與細胞周期阻滯及抑制凋亡抑制蛋白Survivin的表達有關。

【關鍵詞】肺癌槲皮素細胞凋亡Survivin

肺癌是在全球范圍內導致死亡的主要原因之一，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占80%~85%，約45%的患者就診時已是ⅢA/B期[1]。肺癌患者的治療現狀不容樂觀，由于早期診斷率較低，多數患者發現時已發生病灶轉移；而耐藥現象的產生更為棘手，即便是當前最好的治療方案，也只有早期肺癌患者的治愈率較高。傳統手術、放化療等仍是目前治療肺癌的主要模式，但其5年生存率＜5%。盡管許多傳統的細胞毒類藥物已被用于治療NSCLC，如長春地辛、多西他賽、卡鉑等[2]，但因不良反應較明顯而使其治療作用降低。中藥在治療惡性腫瘤中因表現出其增效減毒作用而備受關注，但缺乏具體的藥效機制、安全性及毒性等相關的基礎及臨床研究，應用受到限制。近年來，槲皮素抗腫瘤作用逐漸成為人們研究的熱點，而Survivin是具有腫瘤特異性的凋亡抑制蛋白，且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉移密切相關。筆者通過體外細胞學檢測凋亡抑制蛋白Survivin的表達來評估槲皮素是否具有抗肺癌活性，從而推測槲皮素治療肺癌的潛在可能性，現報道如下。

1　材料和方法

1.1材料人肺腺癌細胞株A-549購于上海中科院細胞生物研究所；槲皮素（美國Sigma公司），噻唑藍(MTT)（上海Fluka公司），兔抗鼠Survivin抗體（美國Cell Signaling公司），超凈工作臺（新加坡ESCO公司），CO2培養箱（美國Shellab公司），倒置顯微鏡（德國Leica公司），流式細胞儀（美國Couher公司），酶標儀（德國BMG公司），微量加樣器，一次性微孔濾器（0.22μm），離心管，96孔細胞培養板（美國Costar公司），紫外燈，冰箱。

1.2方法

1.2.1槲皮素對細胞株A-549體外增殖的影響試驗組設有空白對照組（細胞培養液中不加藥）、給藥試驗組（細胞培養液中含10、20、40、60、80、100、120μmol/L槲皮素）。由于槲皮素用二甲基亞砜（DMSO）溶解，為避免DMSO對實驗的影響，設溶劑對照組（細胞培養液中含0.05%DMSO），每組5孔。取對數生長期的A-549細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液配制成腫瘤細胞懸液，接種于96孔培養板中（1×104/孔），培養液體積為150μl/孔。置于37℃、5%CO2培養箱中預培養24h后，用含不同濃度的槲皮素培養4d，在每孔中加入5mg/ml的MTT溶液20μl，孵育4h后，吸去培養液，每孔加入DMSO 100μl，在搖床搖動15min，置于酶標儀中，波長 570nm，計算腫瘤細胞的生長抑制率，抑制率（%）=（1-給藥實驗組A值/溶劑對照組A值）×100%（A值為吸光度值）。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡取對數生長期A-549細胞，調整細胞的初濃度至1×105個/ml并加入24孔板，每孔2ml，細胞貼壁后加入不同劑量的槲皮素，使其終濃度為15、30、60μmol/L，每孔容量均為2ml，每個濃度設2個復孔，不加藥為對照組。培養24 h收獲細胞，10ml PBS洗滌3次，1 000r/min，持續5 min，棄上清液，加入100μl PI染液50μg/ml，置入溫箱內避光40min，放入4℃冰箱過夜，上流式細胞儀，經MODFIT軟件去除細胞碎屑后檢測周期分布及細胞凋亡，CellQuest軟件記錄、分析實驗結果，以上實驗重復3次。

1.2.3倒置顯微鏡觀察將A-549細胞與不同濃度槲皮素作用后置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24h，在倒置顯微鏡下觀察。將單純培養的肺癌細胞作為對照組。

1.2.4熒光顯微鏡形態學觀察細胞爬片培養4h后分為兩組，實驗組加入30μmol/L濃度的槲皮素，對照組加入和實驗組等量的溶液于RPMI 1640培養液中。干預24h后加Heochst33258熒光染色，按試劑盒說明書進行操作，熒光顯微鏡下觀察，攝像。

1.2.5透射電鏡將30μmol/L槲皮素作用A-549細胞24h后，收集細胞，離心，棄上清液，剩下的細胞團用15%戊二醛/PBS固定2h；PBS漂洗3次，15min/次；1%鋨酸后固定1h；梯度丙酮脫水；Epon-812混合樹脂包埋；超薄切片機切片；醋酸鈉和檸檬酸鉛染色；透射電鏡觀察、照相。

1.2.6Western blot檢測細胞Survivin蛋白表達水平細胞與不同濃度（15、30、60μmol/L）槲皮素培養24h后，提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。每孔加入100μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉移至PVDF膜，行麗春紅染色，根據蛋白Marker以確定轉膜效果及靶蛋白的位置。PVDF膜5%BSA中37℃封閉1h，Survivin兔抗鼠單克隆抗體（1∶250）37℃溫育1h，與辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體37℃溫育1h，利用ECL化學發光法進行顯色反應、曝光，Survivin蛋白相對分子質量為29 000，以上每個濃度重復3遍。

1.3統計學處理采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2　結果

2.1槲皮素對A-549細胞增殖的影響溶劑對照組對A-549細胞株增殖影響極小，槲皮素對A-549細胞株增殖有顯著的抑制作用，并呈現明顯的劑量效應關系，詳見表1。

表1　槲皮素對A-549細胞株增殖的抑制作用

2.2細胞周期的分布和凋亡情況槲皮素可通過阻滯細胞周期由G2/M期向G1期的進程，造成G2/M期細胞堆積阻滯，各濃度組間差異有統計學意義（P＜0.01）。每個樣品計數1×105個細胞，上流式細胞儀，在G0/G1期前出現一亞二倍體峰，確認為凋亡峰，該峰面積與槲皮素呈劑量-時間依賴性。同時細胞流式儀檢測顯示隨著槲皮素作用濃度的增大和作用時間的延長，細胞凋亡率逐漸增加，各組間差異均有統計學意義（P＜0.01），詳見表2、圖1。

表2　不同給藥劑量組槲皮素對A-549細胞周期及凋亡的影響

2.3形態學觀察

2.3.1倒置顯微鏡下細胞形態學觀察在倒置顯微鏡下觀察到對照組細胞貼壁生長，呈單層鵝卵石樣緊密排列，形態不規則，有較長的偽足，可融合成集落，細胞分裂增殖旺盛，有多量瘤巨細胞；實驗組經槲皮素處理后，細胞偽足回縮，細胞變小、圓，細胞排列雜亂，或松散或聚集成團，出現懸浮現象，瘤巨細胞減少或不見巨細胞，且存在時間和劑量依賴性，見圖2（插頁）。

2.3.2Heochst 33258染色檢測細胞凋亡情況對照組細胞生長良好，細胞大小均勻、飽滿、胞膜完整。30μmol/ L槲皮素作用24h后，凋亡細胞增多，核質濃縮、形成凋亡小體，見圖3（插頁）。

2.3.3透射電鏡下細胞形態學改變透射電鏡下，肺癌細胞則核大而形狀不規則，核內異染色質很少，核仁大而致密，癌細胞表面有許多大小、形狀不一的突起，胞質內含有豐富的游離核糖體、粗面內質網和線粒體。體外培養A-549肺癌細胞與30μmol/L槲皮素作用24h后，可見到肺癌細胞核內出現濃縮的異染色質，核仁分解為許多嗜鋨酸的細小顆粒，分布于核中央，核膜已經模糊不清，胞質內線粒體外膜開始破壞，嵴變短且數量減少，內質網擴張，但細胞膜完整的細胞凋亡現象，見圖4（插頁）。

2.4各組A-549細胞中Survivin蛋白表達水平15、30、60μmol/L槲皮素作用 24 h后蛋白樣品的Survivin/ actin灰度值比分別為 0.89±0.11、0.69±0.13、0.56± 0.10，與未處理組的灰度值比0.97±0.02比較差異有統計學意義（P＜0.05），而且槲皮素濃度15μmol/L與30μmol/L、30μmol/L與60μmol/L比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖1　24h槲皮素作用于肺癌A-549細胞周期及凋亡變化（A：空白組；B：15μmol/L槲皮素；C：30μmol/L槲皮素；D：60μmol/L槲皮素）

圖2　不同濃度重樓醇提取物作用于肺癌A-549細胞24h形態（A：對照組；B：15μmol/L槲皮素；C：30μmol/L槲皮素；D：60μmol/L槲皮素；×400）

圖3　Hoechst33258染色的凋亡細胞形態（A：對照組；B：30μmol/L　

圖4　透射電鏡觀察槲皮素誘導的凋亡細胞形態（A：×60 000；

圖5　Western blot檢測各處理組A-549細胞Survivin蛋白表達水平（A：0；B：15μmol/L；C：30μmol/L；D：60μmol/L）

3　討論

肺癌在全世界范圍內成為導致癌癥死亡的首要原因，根據2001—2007年對美國患者的統計，診斷為NSCLC晚期階段的患者5年存活率為3.6%。目前，以鉑類為基礎的聯合化療方案仍是其主要的治療模式，但在提高患者生存率方面已達到平臺期[3-4]，在聯合靶向治療如貝伐單抗、吉非替尼等，其方案顯示出一定的獲益率[5-6]，但也僅僅是針對經選擇后的小部分合適患者，因而尋求一種新型有效的化療藥物顯得尤為重要。

中藥治療腫瘤是我國在腫瘤治療上的一大特色，由于中藥的不良反應小，對人體損害少，使得中藥抗腫瘤研究備受關注。國內外學者應用中藥單藥、復方或從中提取的有效成分對腫瘤細胞進行誘導凋亡的研究取得了可喜的成果。中醫藥在中晚期NSCLC治療中具有一定的優勢，亦顯示出強大的生命力。目前薈萃分析已證實適當食用富含黃酮類蔬菜可一定程度降低發生肺癌的風險率[7]。已有研究證實，槲皮素涉及的抗肺癌的作用機制主要有影響p450及GST基因的表達[8]，除此之外，與抑制腫瘤細胞增殖，包括抑制氧自由基釋放[9-10]，細胞周期阻滯[11]及凋亡[12-13]相關。

Survivin是迄今為止發現最強的凋亡抑制因子之一，它特異性地表達于胚胎發育組織及分化未成熟組織，并在幾乎所有惡性腫瘤組織中出現高表達，而在正常成人組織中不表達（胸腺、胎盤、子宮內膜除外），并且與腫瘤的發生、發展及預后密切相關[14]。它不僅可以通過結合活性caspase-3和caspase-7產生直接抑制效應，還可通過細胞周期抑制蛋白p21間接抑制caspase而阻止細胞凋亡[15]。Survivin與細胞周期依賴蛋白激酶CDK4結合，形成Survivin/CDK4復合物，使CDK2/cyclinE激活，Rb磷酸化導致 p21從 p21/CD K4復合物中釋放出來，p21能與線粒體的caspase-3前體相互作用，從而抑制Fas介導的凋亡。已知Survivin抑制細胞凋亡的作用是受多種因素調控的，它的磷酸化與否是決定其活性有無的一個重要因素。Survivin是周期蛋白激酶p34cdc2-cyclin B1的有絲分裂底物，而p34cdc2-cyclin B1是調控G2/M期的重要蛋白；Survivin的蘇氨酸34磷酸化后與caspase-9結合并抑制其活性，阻斷由caspase-9介導的細胞凋亡信號傳導[16]。Falleni等[17]在Ⅰ期NSCLC的手術切除標本的研究中發現，有96%（76/80）的標本Survivin基因表達陽性，顯示Survivin基因在肺癌早期診斷中的價值。Karczmarek等[18]在對肺癌的預后研究中發現，肺癌患者中大部分有Survivin的過表達，生存中值（14個月）明顯低于無過表達的患者（60個月）。Ikehara等[19]研究發現：肺癌TNM分期愈晚、組織分化惡性度愈高，Survivin mRNA陽性表達率也愈高，這表明Survivin基因可能與腫瘤的侵襲性和預后相關。

凋亡與抗凋亡之間的平衡在各種腫瘤的發病機制中扮演重要角色。已證明Survivin在腫瘤細胞中能夠抑制凋亡并促進其有絲分裂，抑制Survivin功能能夠促進細胞凋亡并抑制其增殖，從而為抗腫瘤治療提供了一個新的靶點。本研究發現，槲皮素能夠抑制人肺腺癌A-549細胞的增殖并誘導其凋亡，且Survivin蛋白的表達隨著槲皮素的濃度增加而下降，表現出一定的劑量依賴性，從而推測槲皮素抑制肺癌細胞的凋亡可能是通過抑制凋亡抑制蛋白Survivin的表達來實現的。通過轉染Survivin反義寡（脫氧）核苷酸后能夠抑制Survivin的表達并能促進肺癌細胞的凋亡，抑制其增殖，或是通過Survivin基因特異性RNA干擾，可以明顯抑制肺癌細胞的體外增殖并誘導明顯的細胞凋亡[20]。因此，筆者推測，Survivin的表達可能在槲皮素抑制肺癌細胞增殖和誘導凋亡中發揮了重要作用。此外，本研究發現槲皮素能導致人肺腺癌A-549細胞發生G2/M期阻滯，這與Survivin的轉錄受到嚴格控制只在G2/M期表達是否有相關性，是否因為G2/M期的阻滯而導致Survivin的低表達還有待于進一步的研究證實。

4　參考文獻

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（本文編輯：嚴瑋雯）

《浙江醫學》對計量單位的要求

本刊執行GB 3100～3102-1993《量和單位》中有關量、單位和符號的規定及其書寫規則，具體執行可參照中華醫學會雜志社編寫的《法定計量單位在醫學上的應用》。注意單位名稱與單位符號不可混用。組合單位符號中表示相除的斜線多于1條時應采用負數冪的形式表示，組合單位中斜線和負數冪亦不可混用，如ng/kg/min應采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。在敘述中應先列出法定計量單位數值，括號內寫舊制單位數值；如果同一計量單位反復出現，可在首次出現時注出法定與舊制單位換算系數，然后只列法定計量單位數值。量的符號一律用斜體字，如吸光度（舊稱光密度）的符號“A”。血壓仍以mmHg表示。

本刊編輯部

收稿日期：（2013-10-08）

作者單位：310002杭州市第一人民醫院吳山院區放療科（徐曉、張珂）；浙江大學醫學院附屬第二醫院呼吸內科（劉進）

通信作者：徐曉，E-mail：xuxiao116@sina.com

Quercetin inhibits proliferation and induces apoptosis of human lung cancer A-549 Cells in vitro

XU Xiao,LIU Jin,ZHANG Ke. Department of Radiation,Wushan Campus,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310002,China

【 Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of quercetin on proliferation and apoptosis of human lung cancer cell line A-549 in vitro.MethodsThe cultured A-549 cells were treated with different concentrations of quercetin,and cell proliferation and apoptosis were detected by MTT and flow cytometry,respectively.The morphological changes of the apoptotic cells were observed by invert microscopy,transmission electron microscopy and Heochst33258 fluorescence staining.The expression of survivin was analyzed by Western blot.ResultsAfter treatment of quercetin for 24 h the proliferation of A-549 cells was inhibited in a dose-dependent manner,and cells were arrested at the G2/M phase.The apoptosis rates of quercetin treatment groups(15, 30,60μmol/L)were(7.24±1.73)%,(12.57±2.72)%and(26.02±1.67)%,respectively,significantly higher than that of control group [(2.67±2.32)%,P＜0.01].Apoptosis or necrosis of A-549 cells were morphologically observed after quercetin treatment for 24h. The expression of survivin protein in quercetin-treated A-549 cells was decreased in a dose-dependent manner.Conclusion Quercetin can inhibit proliferation and induce apoptosis of human lung cancer A-549 cells,which is associated with cell cycle arrest and down-regulation of survivin expression.

【Key words】Lung CancerQuercetinApoptosisSurvivin