混菌固態發酵生產蓖麻餅肥工藝條件的優化

王海濤，王昌祿*，李貞景，陳勉華

（天津科技大學 食品工程與生物技術學院，天津 300457）

蓖麻餅粕是蓖麻籽榨油后的副產物，含有豐富的蛋白質和多種氨基酸及礦質元素[1-2]。蓖麻餅肥具有植物生長所需的氮、磷、鉀3大元素，尤以氮肥效力最高[3]。蓖麻餅肥含碳水化合物多，纖維素在蓖麻餅粕中含量達到了30%以上[4]，發酵時能產熱，會發熱燒根、燒種[5-6]。在傳統的有機肥堆制中，主要是利用原有的土著微生物進行自然發酵，生產周期長，營養元素損失嚴重，效果不理想[7]。針對這一問題，申建美等[8-12]分別利用不同方法選育了能加快有機物料降解的微生物，并進行了相關研究。在作物生長所需養分中，氮素可利用量的多少是限制作物生長的一個主要因素[13-14]，而有機肥與化學肥料相比的一個缺點就是肥效緩慢，不能滿足前期作物對營養元素的需求[15]。蓖麻餅粕中的蛋白質含量豐富，具有提供高氮肥質量的潛力，直接施于農田，農作物無法吸收利用，經過微生物的分解作用，可將大分子蛋白質分解為多肽和游離氨基酸，易于被作物吸收利用。為高效利用蓖麻餅粕，采用生物技術手段，篩選出能夠高效降解纖維素和蛋白質的微生物，添加到餅粕中進行發酵，達到縮短周期，減少營養素的損失，提高肥料利用率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓖麻餅粕：山東某蓖麻榨油生產基地提供；麩皮：市售。

菌種：天津科技大學食品生物技術實驗室保存的產纖維素酶菌株T1-2和產蛋白酶菌株P3-2。

種子液培養基：羧甲基纖維素鈉（carboxy methylated cellulose-Na，CMC-Na）10g，蛋白胨3g，KH2PO44g，牛肉膏5g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1 000mL。

固態發酵培養基：粉碎過40目篩的蓖麻餅粕8g，麩皮2g，MgSO4·7H2O 0.04g，CaCl20.02g，KH2PO40.04g，加6mL水攪拌均勻。

以上培養基滅菌條件為121℃、20 min。

水合茚三酮（分析純）：天津市百世化工有限公司；3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

HH-B11型電熱恒溫培養箱：天津市實驗儀器廠；SP-2102UV型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；CL-32L型全自動智能高壓蒸汽滅菌器：日本ALP公司；TDA8002型電熱恒溫水浴鍋：天津市中環實驗電爐有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 產淀粉酶測定試驗

將菌種點接于產淀粉酶鑒定培養基上，30℃倒置于恒溫培養箱中培養，待長出較大菌落后在其周圍的培養基滴加少許碘液，以剛好均勻覆蓋培養基表面為宜，觀察菌落周圍培養基有無顏色變化。

1.3.2 培養方法

將活化后的產纖維素酶菌T1-2和產蛋白酶菌P3-2接入液體種子培養基中30℃、180r/min搖床培養18h，加入固態發酵培養基中，攪拌均勻，靜置培養，發酵結束后，餅粕在60℃條件下烘干至質量恒定，備用。

1.3.3 固態發酵條件的優化

分別設置不同發酵培養基含水量、發酵時間、菌種接種比例、接種量、發酵溫度、pH值、麩皮含量，進行單因素試驗，發酵結束時測定還原糖和游離氨基酸含量，并在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，以游離氨基酸含量為評價指標，以確定最佳發酵條件。

1.3.4 還原糖含量測定

取發酵后的餅粕樣品少許，60℃烘干，研磨成粉末狀，稱取2.000g，加20mL自來水，30℃、180r/min搖床振蕩1h，取5mL在4 000r/min條件下離心10min，上清液保存備用。

取4支25mL具塞比色管，1號管作為空白對照，各加入1mL蒸餾水，2、3、4號管中加入1mL待測液，1號管以1mL蒸餾水代替，每管均加入1.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，將各管充分搖勻后在沸水浴中加熱10min，取出冷卻后用水用水定容至25mL。以1號管液為空白，在波長540nm處測定其吸光度值。根據3個吸光度值的平均值，在葡萄糖標準曲線上查出相應的還原糖含量，其計算公式：

1.3.5 游離氨基酸含量測定

取發酵后的餅粕樣品少許，60℃烘干，碾磨成粉末狀，稱取0.400g，精確至0.001g。加50mL蒸餾水沸水浴10min，50℃下水浴保溫30min，過濾，將濾液定容至100mL。混勻后吸取1mL濾液到20mL比色管中，加1mL蒸餾水，水合茚三酮3mL，0.1%抗壞血酸0.1mL，加塞，密封于沸水中加熱15min，用冷水迅速冷卻并不時搖動使加熱時形成的紅色被空氣逐漸氧化褪去，待呈現蘭紫色時，用體積分數為60%乙醇定容至20mL，搖勻，在波長570nm處測定其吸光度值。求3次重復的平均值，由標準曲線得知各樣品的氨基酸含量，氨基酸含量計算公式：

2 結果與分析

2.1 產淀粉酶試驗

按照1.3.1的方法，研究菌株T1-2和菌株P3-2有無淀粉酶活力。2株菌經30℃恒溫培養箱中培養，待平板培養基上長出較大菌落后，滴加碘液，菌落周圍沒有出現透明圈，平板培養基上都是藍色，說明2株菌都不產胞外淀粉酶。試驗結果表明，用這2株菌混合發酵蓖麻餅粕后，餅粕中的還原糖含量的變化主要是由菌株T1-2產的纖維素酶降解纖維素及2株菌生長利用所致。

2.2 水分含量對發酵效果的影響

水分含量對發酵效果的影響見圖1。

圖1 水分含量對發酵效果的影響Fig.1 Effect of moisture on fermentation

由圖1可知，在菌株T1-2和菌株P3-2混合發酵蓖麻餅粕中，水分含量的變化對發酵效果具有一定影響。隨著水分含量的增加，游離氨基酸含量和還原糖含量都升高，在水分含量為40%時達到最高，之后隨著水分含量的增加，游離氨基酸含量和還原糖含量逐漸降低。試驗結果表明，水分含量為40%時最有利于發酵。

2.3 發酵時間對發酵效果的影響

發酵時間對發酵效果的影響見圖2。

圖2 時間對發酵效果的影響Fig.2 Effect of culture time on fermentation

由圖2可知，不同發酵時間對菌株T1-2和菌株P3-2混合發酵蓖麻餅粕具有較大影響。其中，游離氨基酸含量隨著發酵的進行，逐漸升高，并在第5天達到最高點，之后隨著發酵的延長逐漸降低。還原糖含量則在第6天達到最高。前期游離氨基酸和還原糖含量的升高，可能是由于培養基中接種的產纖維素酶和產蛋白酶菌產生了作用。菌株T1-2分泌的纖維素酶分解固態培養基中的纖維素為還原糖，菌株P3-2分泌的蛋白酶分解固態培養基中的蛋白質為游離氨基酸，隨著發酵的進行分游離氨基酸含量和還原糖含量別在第5天和第6天達到最大值，之后由于培養基環境的改變使產酶量降低，加上微生物的吸收利用，又使其的含量有所下降。試驗結果表明，發酵5d時發酵效果最好。

2.4 菌種比例對發酵效果的影響

菌種比例對發酵效果的影響見圖3。

圖3 接種比例對發酵效果的影響Fig.3 Effect of inoculation proportion on fermentation

由圖3可知，菌株T1-2和P3-2的菌種比例對發酵效果具有一定的影響。按1∶1的比例可使發酵效果最好，游離氨基酸和還原糖含量都最高，菌種比例的升高或降低都會使游離氨基氮及還原糖含量降低。

2.5 接種量對發酵效果的影響

接種量對發酵效果的影響見圖4。

圖4 接種量對發酵效果的影響Fig.4 Effect of inoculum on fermentation

由圖4可知，在菌株T1-2和P3-2混合比例為1∶1的基礎上，接種量對菌株T1-2和菌株P3-2混合發酵蓖麻餅粕具有一定影響。游離氨基酸和還原糖含量的變化趨勢基本一致，混合菌種接種量為14%時發酵效果最好，游離氨基酸和還原糖含量都最高，接種量為7%時稍次之，接種量超過21%則會使游離氨基氮及還原糖含量降低。

2.6 溫度對發酵效果的影響

發酵溫度對發酵效果的影響見圖5。

圖5 溫度對發酵效果的影響Fig.5 Effect of culture temperature on fermentation

由圖5可知，溫度對菌株T1-2和菌株P3-2混合發酵蓖麻餅粕具有較大影響。隨著發酵溫度的升高，游離氨基酸和還原糖含量都逐漸增加，其中游離氨基酸含量在35℃發酵時最高，還原糖含量在30℃發酵時最高，之后隨著發酵溫度的升高，游離氨基氮及還原糖含量都逐漸降低。試驗結果表明，發酵溫度為30℃時發酵效果最好。

2.7 pH值對發酵效果的影響

pH值對發酵效果的影響見圖6。

圖6 pH對發酵效果的影響Fig.6 Effect of pH value of substrate on fermentation

由圖6可知，pH值對菌株T1-2和菌株P3-2混合發酵蓖麻餅粕具有一定影響。其中，在pH 3～5范圍內，還原糖含量隨著pH值的增加逐漸降低，從pH值為6開始，又逐漸升高。游離氨基酸含量隨著pH值的增加逐漸升高，在pH值為4時達到最高，之后有所下降，從pH值為6開始又逐漸升高。試驗結果表明，pH值為4時發酵效果最好。

2.8 麩皮含量對發酵效果的影響

麩皮含量對發酵效果的影響見圖7。

由圖7可知，游離氨基酸的含量隨著麩皮含量的增加逐漸減少，而還原糖含量則隨著麩皮含量的增加逐漸升高。原因可能是麩皮的添加增加的基質的透氣性，有利于產纖維素酶菌T1-2分泌纖維素酶，進而降解較多的纖維素；而添加麩皮在增加透氣性的同時也降低了底物的蛋白質含量，使得產蛋白酶產生菌可接觸分解的蛋白質減少。麩皮營養成分很豐富，含有蛋白質、碳水化合物、維生素、多種礦質元素等成分，作為發酵基質麩皮在發酵培養時有許多的作用，可作為碳氮源發酵產酶，還可為菌株生長代謝提供微量元素和其他生長因子。綜合考慮以上試驗結果，麩皮含量為20%時發酵效果最好。

圖7 麩皮添加比例對發酵效果的影響Fig.7 Effect of bran addition on fermentation

2.9 培養條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選出對發酵效果影響較大的4個主要因素：含水量A、接種量B、溫度C、時間D，進行4因素3水平正交試驗，測定其對游離氨基酸含量的影響及其最佳水平。培養條件優化正交試驗結果見表1，方差分析結果見表2。

表1 培養條件正交優化試驗結果及分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiment for fermentation conditions optimization

表2 正交試驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表1和表2可知，4個因素中含水量對2株菌混合發酵餅粕后游離氨基酸含量影響最大，其次分別為接種量、溫度、時間。正交試驗極差分析得到的培養條件優化組合為A3B3C3D3，即含水量50%、接種量15%、溫度36℃、時間7d。在此最佳培養條件進行驗證試驗，發酵后游離氨基酸含量為1.68%。

3 結論

利用菌株T1-2和P3-2混合發酵蓖麻餅粕，試驗結果表明，2株菌都不產胞外淀粉酶。綜合考慮游離氨基酸和還原糖含量2種指標，單因素試驗結果為水分含量40%，發酵時間5d，菌種比例1∶1，接種量14%，發酵溫度30℃，pH值為4，麩皮含量20%。但游離氨基酸含量的變化和還原糖含量的變化趨勢不完全一致，以游離氨基酸含量為評價指標時，最優培養條件的優化組合為含水量50%、接種量15%、溫度36℃、時間7d。在此最佳條件下，發酵后游離氨基酸含量為1.68%。

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