野木瓜提取液的抗氧化活性研究

崔霖蕓

（遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校基礎(chǔ)部，貴州 遵義 563003）

自由基是含有一個或多個不對稱電子的原子、分子或離子。正常條件下，生物體內(nèi)僅1%～4%的O2產(chǎn)生超氧陰離子（O2－·）和羥自由基（·OH），但當(dāng)線粒體的結(jié)構(gòu)與功能受影響時，自由基產(chǎn)生增多[1]。自由基具有很強(qiáng)的氧化能力，若其數(shù)量超過機(jī)體的清除能力時便會對機(jī)體產(chǎn)生損傷，會直接或間接地降低酶活性，促使多糖降解、DNA 鏈斷裂，從而引起體內(nèi)代謝紊亂，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生[2]。因此，清除自由基對維持健康、延緩衰老、防癌抗癌等方面均有積極的作用。天然植物中含有豐富的抗氧化性物質(zhì)（如黃酮類化合物、多酚化合物、多糖化合物等）。研究顯示，物質(zhì)的還原力與其抗氧化性間有顯著的正相關(guān)性，還原力的高低可反映抗氧化能力的強(qiáng)弱[3]，黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)中具有數(shù)量不等的酚羥基因而具有較強(qiáng)的還原性，是很有潛力的抗氧化劑[4-5]。多酚類化合物是極好的氫或電子供體，且不會引發(fā)新的游離基或由于鏈反應(yīng)而被迅速氧化，具有很好的抗氧化效果[1]。多糖結(jié)構(gòu)中的醇羥基可以與產(chǎn)生·OH等自由基所必需的金屬離子絡(luò)合，使羥自由基的產(chǎn)生受到抑制[2，6]，從而具有一定的抗氧化性。此外，皂苷類、鞣質(zhì)類、褪黑素類、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)等均有一定的抗氧化作用[1]。

野木瓜（Stauntonia chinensis）是木通科（Lardizabalaceae）野木瓜屬植物。貴州省正安縣于1996 被國務(wù)院發(fā)展研究中心等單位命名為“中國野木瓜之鄉(xiāng)”，其盛產(chǎn)的野木瓜以果大、皮薄、肉細(xì)、氣香、味甘酸等特點著稱[7]。中醫(yī)典籍記載其莖葉微苦，其果味甘、平，歸心、腎經(jīng)[8]，具有舒筋活絡(luò)、解渴生津、平肝和胃、祛風(fēng)止痛等功效。現(xiàn)代研究表明，野木瓜中含有豐富的皂苷和木脂素苷類化合物，還含有黃酮苷類化合物、酚性成分、多糖類化合物[9]。此外，野木瓜果實中含有豐富的有機(jī)酸、果膠、胡蘿卜素、黃酮類、氨基酸、多種維生素和多種礦物質(zhì)等[10]，這些物質(zhì)很多是天然的抗氧化劑。國內(nèi)外對野木瓜的鎮(zhèn)痛抗炎、放射增敏及肝保護(hù)等方面的研究較多[11-12]，但對野木瓜提取物的抗氧化能力的研究卻很少。顯然，在人們?nèi)找骊P(guān)注自身保健的今天，若能發(fā)現(xiàn)野木瓜的抗氧化功效，將對開發(fā)其在保健、防癌抗癌方面的新用途具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮野木瓜果：購自貴州正安縣。

石油醚（化學(xué)純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、水揚酸、H2O2、HCl（化學(xué)純）：天津天大化學(xué)試劑廠；VC（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鐵氫化鉀、三氯乙酸、FeCl3、鄰苯三酚（分析純）：西安三浦化學(xué)試劑有限公司；pH=6.6的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液（配制方法見文獻(xiàn)[13]）、pH=8.34的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液（配制方法見文獻(xiàn)[14]）。

1.2 儀器與設(shè)備

752N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SHZ-DⅢ型予華牌循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；BSA223型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；TL80-2型離心機(jī)：姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司；DK-S26 型恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；PHS-2F型精密酸度計：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將野木瓜鮮果洗凈→去籽囊切成2～5mm 薄片→50℃烘干→粉碎后過40 目篩→石油醚脫色回流至石油醚無色→抽濾，濾渣風(fēng)干。

（1）準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的野木瓜粉5g，置入250mL圓底燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)83%的乙醇151mL，在70℃回流浸提2h，抽濾，濾液在60℃減壓濃縮，最后定容至25mL，得野木瓜醇提物。

（2）準(zhǔn)確稱取處理后的野木瓜粉5g，置入250mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水151mL，在70℃回流浸提2h，抽濾，濾液在60℃減壓濃縮，最后定容至25mL，得野木瓜水提物。

表1 實驗取樣方案Table 1 Experimental design of sampling

1.3.2 野木瓜提取液還原力的測定[2，15-16]

試驗采用Oyaizu法，主要根據(jù)待取液能將Fe3+還原為Fe2+的多少來檢測其還原能力。取表1中的各組待試液，分別加入pH=6.6的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液5.0mL，加入1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鐵氫化鉀3.0mL，50℃水浴恒溫反應(yīng)20min后急速冷卻，加入10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸3.0mL搖勻，于3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，依次加入蒸餾水2.0mL，0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）FeCl30.5mL，搖勻，靜置10min，在波長700nm處測吸光度值，吸光度值越大則還原力越強(qiáng)。

1.3.3 野木瓜提取液對羥基自由基（·OH）的清除率的測定[16-18]

采用Fenton法，其基本原理：在過渡金屬離子催化作用下，過氧化氫可發(fā)生均裂產(chǎn)生羥自由基（·OH），反應(yīng)式為：

水楊酸捕獲·OH產(chǎn)生有色物質(zhì)，通過測定吸光度值，可以得出·OH的多少，若加入具有清除·OH功能的待測液，便會與水楊酸競爭·OH，從而使反應(yīng)生成的有色物質(zhì)減少，由此可測定待測液對·OH的清除能力。

參照上述文獻(xiàn)方法，在19支25mL容量瓶中分別加入3.0mL 2mmol/L的FeSO4和3.0mL 6mmol/L的水楊酸，搖勻，加入表1中的各組待測液，最后向各容量瓶中分別加入3.0mL 2mmol/L的H2O2，搖勻后置入37℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)15min，取出在波長510nm處測吸光度值A(chǔ)，得到各待測液對·OH的清除率：

式中：A0為未加待測液（即加入4mL 蒸餾水）的吸光度值；Ax為加入各待測液后的吸光度值。

1.3.4 野木瓜提取液對超氧陰離子（O2－·）清除率的測定[16，19-20]

參考上述文獻(xiàn)的鄰苯三酚自氧化法，取pH=8.34的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液4.7mL，加入4.0mL蒸餾水搖勻，加入3mmol/L的鄰苯三酚0.3mL（以10mmol/L的HCl配制，空白管用10mmol/L的HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液），迅速搖勻倒入比色皿（1cm）中，在波長325nm處測吸光度值，每隔30s記錄1次，至4.5min止，將所測吸光度值與時間回歸，其斜率即為鄰苯三酚自氧化速率。

樣品清除超氧陰離子自由基的測定：操作方法同上，在加入鄰苯三酚前，先將4.0mL蒸餾水換成表1中的各組待測液，按上述方法測吸光度值，回歸求得加入待測液后的鄰苯三酚自氧化速率。

式中：V0為未加待測液（即加入蒸餾水）時鄰苯三酚自氧化速率；Vx為加入待測液后的鄰苯三酚自氧化速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 野木瓜提取液還原力的測定

由圖1可見，隨著野木瓜提取液（或VC濃度）的增加，吸光度值剛開始迅速增加，當(dāng)提取液的量增加至1.5mL（或VC濃度增加至0.3mg/mL）后，增長趨于平緩。吸光度值的大小反應(yīng)了還原力的強(qiáng)弱，由圖1可知，還原力由強(qiáng)到弱依次為VC＞野木瓜醇提物＞野木瓜水提物。當(dāng)加入野木瓜醇提物4mL時（相當(dāng)于從0.8g野木瓜粉中提取的液量，換算過程為5g÷25mL×4mL=0.8g，參見1.3.1），其還原力只是略低于0.8mg/mL的VC的還原力，說明野木瓜提取物有較強(qiáng)的還原力。還原力與抗氧化性間顯著正相關(guān)，還原力的高低反映了抗氧化能力的強(qiáng)弱[21]。因此說明野木瓜提取液有較強(qiáng)的抗氧化能力。

圖1 野木瓜提取液的還原力Fig.1 Reducing power of S.chinensis extraction solution

2.2 野木瓜提取液對羥基自由基（·OH）的清除作用

圖2 野木瓜提取液對·OH的清除Fig.2 ·OH scavenging effects of the S.chinensis extraction solution

圖2是不同量的野木瓜提取液與不同濃度VC對·OH的清除作用的對比曲線。當(dāng)加入野木瓜提取液的量較少時（或VC濃度較低時），對·OH的清除作用均較小，不到20%，隨著添加提取液量（或VC濃度）的增加，清除率迅速上升，其中VC的清除率上升最快，并迅速超過野木瓜提取液的清除能力，野木瓜兩種提取介質(zhì)（乙醇和蒸餾水）的提取液對·OH的清除作用差別不明顯。當(dāng)加入提取液的量超過2mL（或加入VC的質(zhì)量濃度超過0.4mg/mL）后對·OH的清除作用增速趨于平緩。當(dāng)加入4mL野木瓜提取液（相當(dāng)于從0.8g野木瓜中提取的量），對·OH的清除率可達(dá)77.42%（水提物）和76.66%（醇提物），與0.246mg/mL VC的清除率79.26%幾乎相當(dāng)（即加入4mL的0.8mg/mL VC的清除率，總反應(yīng)液量為13mL（見1.3.3），因此，反應(yīng)液中VC的質(zhì)量濃度為0.246mg/mL，說明野木瓜提取液對·OH有很好的清除作用。

2.3 野木瓜提取液對超氧陰離子（O2－·）的清除作用

圖3 野木瓜提取液對清除Fig.3 scavenging effects of the S.chinensis extraction solution

圖3給出了不同量的野木瓜提取液與不同濃度VC對超氧陰離子（O－2·）的清除作用對比，野木瓜乙醇提取液對O－2·的清除作用明顯高于其水提取液，這可能是乙醇提取液中溶出了更多黃酮類化合物的原故。野木瓜醇提物對O－2·的清除作用與VC的作用幾乎相當(dāng)，變化也相似。在加入醇提物的量較少（或VC濃度較低時），對O－2·的清除作用也較小，不到35%，但隨著量的增加，清除作用迅速增加，在超過2mL后（此時清除率達(dá)到87.42%）增速趨于緩和。當(dāng)加入4mL提取液量（相當(dāng)于從0.8g野木瓜粉中提取的液量），對O2－·的清除率可達(dá)到96.36%（乙醇提取），與0.356mg/mL的VC的清除率96.69%相當(dāng)（此處即為加入4mL 0.8mg/mL的VC時的清除率，總反應(yīng)液量為9mL（見1.3.4），因此，反應(yīng)液中VC的質(zhì)量濃度為0.356mg/mL），說明野木瓜乙醇提取液對O－2·有很好的清除作用。野木瓜水提取物對O－2·的清除作用稍小，但當(dāng)加入液量為4mL時，也達(dá)到90.78%，說明野木瓜水提物對O－2·也有較好的清除作用。

3 結(jié)論

實驗證實野木瓜乙醇提取液的還原力高于其水提取液的還原力，但均略低于VC的還原力，但在清除羥基自由基（·OH）能力上，醇提物與水提物及一定濃度的VC大致相等，野木瓜乙醇提取物對超氧陰離子（O－2·）的清除力與VC相當(dāng)，超過了96%，高于水提物的清除力。本實驗的不足在于，由于實驗條件及時間的局限，沒有對野木瓜提取液的成分進(jìn)行定量分析，但據(jù)文獻(xiàn)報道可推測野木瓜的抗氧化性主要可能來源于野木瓜中的黃酮類化合物、多酚類化合物、多糖類化合物[1-6]。醇提物在總還原力和對超氧陰離子的清除力上均高于水提物，可能是由于醇提物中溶解了更多的黃酮和多酚類化合物（根據(jù)極性相似相溶原理），而水提物中溶解了更多的多糖類化合物，提高了水提物對羥自由基的清除作用（多糖類化合物對羥自由基有較好的清除作用[2，6]）。本研究從總體上證明了野木瓜有很好的抗氧化作用，是一種較好的天然抗氧化劑，因此，對推廣和開發(fā)野木瓜飲品、食品、保健藥品等具有一定的指導(dǎo)作用。

[1]劉樹興，趙 芳.從天然植物中開發(fā)抗氧化劑研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（7）：179-182.

[2]張春梅，宋 海，魏生龍.荷葉離褶傘菌絲體多糖的提取及還原力的研究[J].中國食用菌，2012，31（6）：44-48.

[3]邢 懿，梁 波，汪 璐，等.黃山杜鵑總黃酮的體外抗氧化活性研究[J].華西藥學(xué)雜志，2013，28（1）：53-55.

[4]張 琳，陸維敏.黃酮類化合物抗氧化性能與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系[J].浙江大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版，2006，33（2）：187-191.

[5]潘國慶，梁永欣.黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與抗氧化活性關(guān)系研究[J].青海科技，2005（3）：28-30.

[6]趙云濤，國興明，李付振.金櫻子多糖的抗氧化作用[J].生物學(xué)雜志，2003，20（2）：23-24.

[7]王文平，郭祀遠(yuǎn)，李 琳，等.野木瓜多糖中糖醛酸含量測定[J].食品科技，2007（10）：84-86.

[8]苗明三.法定中藥藥理與臨床[M].北京：世界圖書出版公司，1998.

[9]陳 瑛，李 錦，吳英良.野木瓜化學(xué)成分及其藥理和臨床研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2008，25（11）：924-928.

[10]張 毅，王少敏.木瓜高效栽培與利用[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[11]陳國棟，楊 磊，陳少丹，等.野木瓜屬植物化學(xué)成分和生物活性研究概況[J].中藥材，2008（2）：309-315.

[12]陳 瑛，李 錦，吳英良.野木瓜化學(xué)成分及其藥理和臨床研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2008（11）：924-928.

[13]龐戰(zhàn)軍.自由基醫(yī)學(xué)研究方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000.

[14]袁道強(qiáng)，黃建華.生物化學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2006.

[15]汪海波，劉大川，佘珠花，等.大豆異黃酮類物質(zhì)的提取、抗氧化性及穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué)，2004，25（1）：111-115.

[16]莫開菊，柳 圣，程 超.生姜黃酮的抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2006，27（9）：110-115.

[17]庫爾班·吐松，展 銳，張 宏，等.頂羽菊抗氧化活性研究[J].生物技術(shù)通訊，2010，21（3）：406-412.

[18]丁利君，周圳輝，林燕如.芒萁中黃酮物質(zhì)的提取及其抗氧化研究[J].食品科學(xué)，2005，26（8）：77-81.

[19]鄒國林，桂興芬，鐘曉凌，等.一種SOD 的測活方法——鄰苯三酚自氧化法的改進(jìn)[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1986（4）：71-73.

[20]曾小玲.七種菊科植物抗活性氧作用的研究對超氧陰離子自由基的清除作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，1999，9（2）：44-52.

[21]邢 懿，梁 波，汪 璐.黃山杜鵑總黃酮的體外抗氧化活性研究[J].華西藥學(xué)雜志，2013，28（1）：53-55.