高效液相色譜法同時測定黑米酒中11種酚類物質

姜 莉，周寶龍，楊 燁，葉群梁，劉學波，王玉堂

(1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西朱鹮黑米酒業有限公司 陜西 洋縣 723300)

黑米酒以黑米為主要原料，通過傳統的發酵和勾兌工藝制成，由于其具有獨特的香氣和風味以及較低的酒精度，受到越來越多消費的青睞[1-2]。黑米中含有豐富的淀粉、蛋白質，組成齊全的氨基酸以及多種微量元素（Se、Zn、Fe、Mn、Ge等）和維生素等營養成分[3]。此外黑米中還含有能調節人體多種生理功能的酚類成分（如花色苷、黃酮以及酚酸類物質等），這些成分具有抗氧化、延緩衰老、降血壓、防齲齒、防輻射、抗過敏、抗癌、抗血小板凝聚、消炎等功能特性[4-5]。黑米作為一種天然保健食品，同時也是功能食品的理想原料[6-7]。近年來，不少地方出現以黑米、紅米等為主要原料的釀酒企業，這對黑米的開發和深加工有著積極深遠的意義。目前，關于黑米酒中酚類活性物質的種類和含量的研究未見報道，建立準確的定量方法對研究黑米酒的保健功能以及質量控制具有重要意義。酚酸類化合物分析的方法有紙色譜、薄層色譜、氣相色譜、高效液相色譜[8-11]、毛細管電泳和膠束毛細管電動色譜等。由于高效液相色譜具有多種組分同時測定，結果準確可靠等特點，廣泛用于食品中黃酮、酚酸類物質的檢測。如李永庫等[12]對葡萄酒、方玲玲等[13]對櫻桃酒、劉群濤等[14]對啤酒、胡華等[15]對醬油、孫崇臻等[16]對蜂蜜中的多種酚酸及黃酮類物質進行測定，建立了可靠的分析方法。本實驗采用高效液相色譜法-二級管陣列檢測（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）法，建立了黑米酒中8種酚酸（沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸和阿魏酸）和3種黃酮類物質（蘆丁、異槲皮苷和槲皮素）同時測定的方法，并用于同類米酒的測定。該方法靈敏度高，結果準確可靠，為研究米酒的功能成分及其質量控制提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米酒：陜西朱鹮黑米酒業有限公司；紅米酒：井岡山市絹花紅米酒廠；黃酒：紹興白塔釀酒有限公司。

沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素標品購于上海純優生物科技有限公司。色譜級甲醇、乙腈、冰乙酸和乙酸乙酯購于美國天地公司。水為蒸餾水和超純水。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀（配SPD-M20A檢測器，SIL-20A自動進樣器及CLASS-VP工作站）：日本島津公司；SHB-Ⅲ循環水式真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；RE52AA旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；生化儀器KQ-600DB數控超聲波清洗器：江蘇昆山超聲儀器公司；PHS-3C酸度計：上海雷磁精科儀器廠；萬分之一天平：梅特勒-托利公司。

1.3 色譜條件

色譜柱C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相A為100%超純水水（含1%乙酸），B 為50%乙腈溶液（含1%乙酸）。低壓梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速1mL/min。沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素檢測波長260nm，咖啡酸、香豆酸和阿魏酸檢測波長320nm，柱溫30℃，進樣量為20μL。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理[17-18]

取一定樣品，用濃鹽酸調至pH=2.0，然后準確吸取樣品10mL于125mL分液漏斗中，加入20mL 水，再加入30mL乙酸乙酯，振搖1min，靜置10min，待分層完全后將下層液再次進行萃取，合并乙酸乙酯層。40℃條件下減壓濃縮至干。殘渣用2mL20%乙腈溶解，0.45μm濾膜過濾，上機測定。

1.4.2 標準溶液的配制

分別精確稱取各標準品5.0mg，用甲醇溶解定容至10mL，得到每個標準品的貯備溶液500mg/L，置于4℃冰箱中避光保存。分別移取1mL 各單個標準貯備溶液混合，用20%乙腈溶液定容至50mL 得到質量濃度為10mg/L混合標準品使用液。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

將11種500mg/L的標準儲備液稀釋后進行進行全波長光譜掃描，各待測的最大吸收波長見表2。實驗確定，定量測定沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素檢測波長為260nm，咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸檢測波長為320nm。

2.1.2 流動相的選擇[19]

以C18色譜柱為固定相時，常用的流動相有甲醇-水、乙腈-水等[20]。但是由于酚羥基、羧基在水溶液中發生電離，極性增強，在固定相表面形成雙重保留，易出現拖尾現象。加入少量酸性試劑，可抑制酚類物質的電離，以中性分子的形態存在，極性減弱，有利于增強在固定相上的保留，提高分離度，避免色譜峰拖尾。分別對水-甲醇體系，水-乙腈體系作為流動相進行比較，實驗最終選擇水為A相，50%乙腈為B相，二者均含有1%乙酸，在此條件下，梯度洗脫時，基線發生較小的飄移，并獲得較好的分離效果。

2.1.3 梯度洗脫條件

由于酚類物質結構性質相似，要實現11種酚類物質的同時檢測，需采用梯度洗脫的方式改善分離度。實驗對洗脫梯度進行優化，確定洗脫程序。洗脫程序見表1。在此梯度洗脫條件下，11種酚類物質達到很好的色譜分離，標樣色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Elution program of mobile phase

圖1 11種酚酸標準品色譜圖(260nm、320 nm)Fig.1 Chromatograms of 11 phenolic acid standards at 260nm and 320nm

2.2 標準曲線的建立

分別取儲備液適量，用甲醇配制0.5mg/L、1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10mg/L的混合標準溶液，在確定的色譜條件下進樣分析，平行測定3次，以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明，11種酚類物質在質量濃度為0.5～10.0mg/L范圍內的線性良好，相關系數R2≥0.996，結果見表2。

表2 11種酚類物質的標準曲線與相關系數Table 2 Standard curves and correlation coefficients of eleven phenolic substances

2.3 精密度實驗

為考察方法的穩定性和重現性，對加標樣品進行重復6次測定，以各組分色譜峰峰面積的計算其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表3，RSD為1.3%～3.3%，由此可見，該方法穩定性和精密度較好。

2.4 加標回收率實驗

表3 方法的精密度和黑米酒加標回收率(n=6)Table 3 Precision and recovery of standard addition of black rice wine

為考察方法的準確度，實驗準確吸取黑米酒10mL，加入2mL 10mg/L的混合標準液，混勻后按照樣品處理的方法進行處理，在上述色譜條件下測定，重復3次，測得回收率結果見表3。11種酚類物質加標回收率為83.5%～105.1%。

2.5 樣品測定

根據前述的樣品提取條件和色譜條件，對黑米酒中的酚類物質進行測定。黑米酒提取液色譜圖見圖2。實驗同時對其他米酒產品的多酚類物質進行分析測定。結果見表4。由此可見，不同米酒中的酚類物質含量差別較大，黑米酒中11種組分均有檢出，其中原兒茶酸含量最高，為7.612mg/L，咖啡酸含量較高，異槲皮苷、蘆丁也明顯高于其他2種米酒。紅米酒、糯米酒中對羥基苯甲酸、咖啡酸相對含量較高。

圖2 黑米酒中酚酸色譜圖(260nm、320nm)Fig.2 Chromatograms of black rice wine at 260nm and 320nm

表4 幾種米酒中黃酮和酚酸類物質的測定結果Table 4 Contents of flavonoids and phenolic acids in rice wine

3 討論與結論

3.1 建立了可用于黑米酒中酚類化合物分析的高效液相色譜方法。采用50%乙腈-超純水（含1%乙酸）為流動相，低壓梯度洗脫，11種酚類物質在45min內得到了較好分離。回收率在83.5%～105.1%，相對標準偏差為1.3%～3.3%。表明該方法準確可靠，可用于米酒中酚類物質測定。

3.2 通過對采用不同原料釀造米酒中的酚類物質檢測發現，米酒中酚類物質的含量和種類與原料來源密切相關，這為米酒類產品的開發及其保健功能的研究提供依據。

3.3 實驗過程中標準物質種類有限，尚有多種酚類物質未能確定，將進一步結合質譜進行判斷。

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