I型糖尿病大鼠血漿胃動素與胃動力之間關系的研究

曹燕飛 張咩慶 陳宏達 王陳芳 杜靜靜

●論 著

I型糖尿病大鼠血漿胃動素與胃動力之間關系的研究

曹燕飛 張咩慶 陳宏達 王陳芳 杜靜靜

目的 探討I型糖尿病大鼠血漿胃動素與胃動力之間的關系。 方法 將Wistar清潔級大鼠30只采用隨機數字表法分為模型組（鏈脲佐菌素30mg/kg，腹腔注射），正常對照組（腹腔注射等量的0．9%氯化鈉溶液）。美藍灌胃實驗測定胃排空率，ELISA法測定血漿胃動素濃度，8周后觀察胃平滑肌組織病理變化。 結果 與正常對照組比較，模型組大鼠血漿胃動素濃度明顯升高（P＜0．05），胃排空率下降（P＜0．01），光鏡下胃平滑肌組織結構紊亂。 結論 I型糖尿病大鼠的胃動力并沒有隨血漿胃動素濃度升高而增強，甚至出現了一定程度的降低，可能與大鼠胃平滑肌組織病變及胃動素抵抗有關。

糖尿病胃輕癱 胃動素 胃動力

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿病常見慢性并發癥之一，是繼發于糖尿病的以胃動力低下、胃排空延遲、胃節律紊亂為特點的臨床綜合征。國外資料顯示，50%的糖尿病患者有消化不良癥狀，50%～76%的糖尿病患者有胃排空延遲[1]。DGP病理機制尚未完全闡明，它可能是自主神經功能障礙、胃腸激素分泌異常、高血糖、平滑肌損害以及微血管病變等因素的綜合影響的結果[2]。本實驗利用小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘導的I型糖尿病大鼠模型，探討其血漿胃動素與胃動力變化的關系，旨在進一步闡明DGP的相關病理機制，為探索新的治療方法提供客觀實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物3月齡雄性Wistar清潔級大鼠30只，體重230～240g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑及造模材料0.9%氯化鈉溶液由杭州民生藥業有限公司提供，生產批號：21201204；10%中性甲醛溶液由上海化學試劑公司提供；STZ由美國Sigma公司提供：將STZ溶于0.1mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液（pH4.5）中，配制成濃度為2%的溶液。

1.3 儀器全自動生化儀器：Hitachi 7600-020Automatic analyzer，株式會社日立高新技術；離心機：Labogenscanspeed 1248R，丹麥Labogene公司；顯微鏡：Olympus BX51，日本奧林巴斯公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 糖尿病大鼠模型的建立 參考相關文獻[3]設計糖尿病大鼠動物模型，將大鼠適應性喂養3d后,采用隨機數字表法將30只大鼠分為2組，每組15只。模型組：大鼠按30mg/kg的劑量腹腔一次性注射2%STZ溶液,以持續1周空腹血糖≥16.7mmol/L為造模成功。正常對照組：大鼠腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。造模后監測大鼠的精神狀況和活動狀況、進食量、飲水量以及尿量，每周測體重1次，取材前1d再測體重。造模后第3天及其后每周采尾血測空腹血糖，取材前再測空腹血糖1次。實驗過程中自由進食飲水。

1.4.2 血漿胃動素濃度測定 造模成功后，采集腹主動脈血2ml，不抗凝，3 000r/min離心15min，收集血漿，用ELISA法測定血漿胃動素濃度。

1.4.3 胃動力學指標測定 8周后,禁食12h，于次日晨，將1mg/ml的美藍溶液0.4ml灌胃，30min后，處死大鼠；取全胃，將胃內殘留物用0.9%氯化鈉溶液4ml沖洗并收集沖洗液，低速離心機3 500r/min，離心15min，取上清液，用722分光光度計在640nm波長檢測吸光度值（OD）。大鼠胃排空情況用胃內色素的殘留率表示，胃內色素殘留率=測定管OD值/標準管OD值×100%。1.4.4 組織病理學檢查 取各組大鼠胃壁組織1塊（10mm×10mm×2mm），置于10%中性甲醛溶液中固定，經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成厚度為5μm的切片，行HE染色，中性樹膠固定。光鏡下觀察胃壁平滑肌組織病理變化。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料均以表示，組間比較采用t檢驗，采用Pearson法進行相關分析。上述步驟均采用單盲法，未告知研究員分組情況。

2 結果

2.1 一般情況 造模后模型組大鼠空腹血糖濃度持續＞16.7mmol/L，并出現了多飲、多食及多尿的糖尿病典型癥狀，I型糖尿病造模成功。

2.2 造模后兩組大鼠空腹血糖水平的比較 見表1。

表1 造模后兩組大鼠空腹血糖水平的比較（mmol/L）

由表1可見，與正常對照組比較，Ⅰ型糖尿病模型組大鼠各個時點的平均空腹血糖濃度均明顯升高（均P＜0.01）。

2.3 造模后兩組大鼠體重的比較 見表2。

表2 造模后兩組大鼠體重的比較（g）

由表2可見，Ⅰ型糖尿病模型組大鼠造模1周后體重較正常對照組明顯低（均P＜0.01）。

2.4 兩組大鼠胃腸動力學及血漿胃動素水平的比較 見表3。

表3 兩組大鼠胃腸動力學及血漿胃動素水平的比較

由表3可見，Ⅰ型糖尿病模型組大鼠的胃內色素殘留率、空腹和餐后血漿胃動素水平均明顯高于正常對照組（P＜0.05或0.01）。

2.5 胃動力與空腹血糖、胃動素的相關分析 Pearson相關分析顯示，Ⅰ型糖尿病模型組大鼠胃內色素殘留率與空腹血糖濃度、血漿胃動素濃度均呈正相關（r= 0.826、0.793，均P＜0.05）。

2.6 胃平滑肌組織病理變化各組大鼠胃平滑肌組織光鏡下觀察 與正常對照組相比，STZ誘導Ⅰ型糖尿病模型大鼠胃壁組織中的平滑肌細胞有不同程度的肌細胞排列紊亂，提示胃壁組織的平滑肌細胞病變，詳見圖1。

3 討論

圖1 光鏡下觀察各組大鼠胃壁平滑肌組織結構變化（A：正常對照組，B：模型組；HE染色，×100）

本實驗模型組大鼠采用STZ腹腔內注射，通過特異性破壞模型組大鼠的胰島β細胞，減少胰島素分泌，誘發Ⅰ型糖尿病。實驗期間模型組大鼠空腹血糖濃度持續＞16.7mmol/L，平均體重明顯低于正常對照組，并出現了多飲、多食及多尿的糖尿病典型癥狀，Ⅰ型糖尿病造模成功。本實驗在造模8周后檢測結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠胃內色素殘留率增加，顯示胃排空能力明顯下降；本實驗糖尿病大鼠存在胃輕癱表現。

胃動素由Mo細胞分泌，分布于小腸，是22個氨基酸組成的多肽。它可以影響胃腸運動和胃腸電活動，對胃蛋白酶的分泌起促進作用，增加胃黏膜血流量但不增加胃酸分泌，使胃體、胃竇及幽門不同區域的肌細胞強烈收縮，并能誘發胃和小腸的移行性運動復合波MMCⅢ相[4]，導致胃產生明顯的收縮運動和小腸明顯的分節運動，對胃排空起到一定的促進作用，同時對胃腸道內容物的清除也發揮了積極的作用。在既往的研究中，胃動素的釋放量被認為與胃腸動力呈正比，即胃動素釋放減少，胃腸蠕動減慢；胃動素釋放減少，胃腸動力降低[5]。

而在本研究中，我們發現發生胃輕癱的Ⅰ型糖尿病模型組大鼠與正常對照組比較，有更高的血漿胃動素水平，兩組間差異有統計學意義。相關分析顯示，模型組的胃內色素殘留水平與胃動素水平存在正相關關系。一些針對Ⅱ型DGP患者的臨床研究同樣顯示DGP患者的血漿胃動素水平較胃排空正常者高[6-7]，與本動物實驗的結果相一致。腸神經系統及平滑肌細胞都有胃動素受體的分布[8]，提示胃動素的作用可能是通過神經通路和對平滑肌的直接作用共同完成的。有研究表明糖尿病模型大鼠的腸神經系統功能及形態結構均顯示異常,腸神經系統的腎上腺能神經纖維腫脹、變性或神經缺失，還有小腸肌間神經叢膽堿能神經遞質的缺失和膽堿酯酶活性增加[9]。同時在體外高糖濃度下的細胞培養到對糖尿病大鼠的體內實驗中，很多學者發現，糖尿病可致不同部位細胞凋亡[10-11]。本研究發現在第8周STZ誘導糖尿病模型大鼠胃壁組織中的平滑肌細胞均有明顯的空泡變性，伴有不同程度的肌細胞排列紊亂，提示胃壁組織的平滑肌細胞病變。這可能導致胃動素對平滑肌的直接作用的減弱，使胃動素代償性釋放增加。

本研究顯示Ⅰ型糖尿病模型組大鼠的血糖水平與胃內色素殘留水平呈正相關。高血糖可影響胃電起步點，使胃電節律紊亂，胃竇收縮減弱，頻率減少，增加孤立性幽門收縮波；減慢正常人及糖尿病患者的胃排空[12]。胃排空延遲所致的胃潴留，胃壁持續擴張和松弛，加之胃內容物中脂肪和蛋白質的刺激，也可使胃動素釋放增加[13]。

綜上所述，Ⅰ型糖尿病大鼠的胃動力并沒有隨血漿胃動素濃度升高而增強，甚至出現了一定程度的降低。有研究稱應用胃動素受體激動劑可改善DGP患者的臨床癥狀[14]，我們推測可能有胃動素抵抗的發生。我們需要進一步的研究以闡明其中的機制。

[1]Camilleri M．Advances in diabetic gastroparesis[J]．Reviews in Gastroenterological Disorders,2002,2(2):47-56．

[2]KE Mei-yun,LAN Yu．Disorders of gastrointestinal motility of diabetes mellitus and possible mechanisms[J]．Chinese Journal of Endocrinology and Metabolism,2003,19:164-165．

[3]邵偉娟,陶凌云,趙茜茹,等．不同劑量STZ誘導小鼠糖尿病模型及生殖能力的研究[J]．上海交通大學學報,2007,25(6):141-143．

[4]李景南,錢家鳴．胃腸激素與消化系疾病[J]．中華消化雜志,2005,25(4): 253．

[5]Esposito S,Valente G,Zavallone A,et al．Histological scorefor cells with irregular nuclear contours for the diagnosis of reflux esophagitis in children[J]．Hum Pathol,2004,35:96．

[5]王青青,張愛珍．2型糖尿病胃輕癱與胃腸激素的相關性[J]．中華內分泌代謝雜志,2004,20(4):324-325．

[6]胡素銀,方逢年,胡少龍,等．糖尿病性胃輕癱患者血漿胃動素的變化[J]．浙江醫學,1999,21(9):550．

[7]Feighner S D,Tan C P,McKee K K,et al．Receptor for motilinidentified in the human gastrointestinal system[J]．Science,1999,284 (5423):2184-2188．

[8]劉梅,董蕾,朱文藝．大鼠杏仁核胃動素受體分布及其作用研究[J]．第一軍醫大學學報,2005,25(9):1100-1105．

[9]Kawagishi T,Nishizawa Y,Okuno Y,et al．Effect of cisapride on gastric emptying of indigestible solids and plasma motilin concentration in diabetic autonomic neuropathy[J]．Am J Gastroenterol 1993,88:933-938．

[10]Cai L,Kang Y J．Cell death and diabetic cardiomyopathy[J]．Cardiovasc Toxicol,2003,3(3):219-228．

[11]史洪濤,房殿春,龍慶林．糖尿病大鼠胃平滑肌細胞凋亡及相關基因蛋白表達的意義[J]．中國臨床康復,2005,9(3):114-117．[12]Petrakis I E．Induced-hyperglycemia attenuates erythromycininduced acceleration of hypertonic liquid-phase gastric emptying in type-I diabetic patients[J]．Dig Dis,1999,17(4):241-247．

[13]羅金燕．胃排空功能的研究[J]．中華內科雜志,1991,30(6):340-342．

[14]Yun-Dan JIA,Chang-Qin LIU,Ming TANG,et al．Expression of motilin in the hypothalamus and the effect of central erythromycin on gastric motility in diabetic rats[J]．Neuroscience Bulletin,2007,23(2):75-82．

Relationship between motilin and gastric motility in diabetic rats

Objective To investigate the relationship between motilin and gastric motility in type I diabetic rats．Methods Thirty Wistar rats were randomly divided into model group and control group．Type I diabetes was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)30mg/kg in model rats,and rats in control group received same volume of normal saline．Gastric emptying rate was determined by methylene blue gavage method．Plasma motilin concentration was determined by ELISA method．Eight weeks later,gastric smooth muscle tissue structure changes were observed． Results Compare with control group,the plasma motilin concentration was significantly higher and the gastric emptying rate was significantly lower in model group(both P＜0．05)．The morphological study showed the structural disorder of gastric smooth muscle tissue．Conclusion The plasma motilin concentration increases and gastric motility is reduced in type I diabetic rats,which may be associated with pathological changes of gastric smooth muscle and motilin resistance．

Pathogenesis of diabetic Gastroparesis Gastric motilin gastric motility

2014-08-12）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省中醫藥科學研究基金計劃（2012ZA068）

310005 杭州,浙江中醫藥大學附屬第三醫院消化內科（曹燕飛、張咩慶、陳宏達、王陳芳）；浙江中醫藥大學附屬第二醫院急診科（杜靜靜）

張咩慶，E-mail：zhangMG5569@sina.com