ALOX5基因啟動子SP-1結合位點多態性與兒童哮喘的相關性研究

劉占利 陳岳明 盛文彬 黃先玫 楊一華 馮亞男 黃暉 鄭緒陽

ALOX5基因啟動子SP-1結合位點多態性與兒童哮喘的相關性研究

劉占利 陳岳明 盛文彬 黃先玫 楊一華 馮亞男 黃暉 鄭緒陽

目的 探討ALOX5基因啟動子SP-1結合位點多態性和漢族兒童支氣管哮喘發生的關聯。 方法 選取88例支氣管哮喘兒童為病例組，124例健康兒童為對照組。用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性（PCR-SSCP）分析ALOX5基因啟動子SP-1結合位點多態性，采用實時熒光逆轉PCR檢測病例組和對照組ALOX5各基因型兒童外周血ALOX5 mRNA表達量。 結果 臨床資料顯示有家族史、非母乳喂養、有過敏史和被動吸煙與兒童支氣管哮喘發病相關（P＜0．05），性別、年齡差異無統計學意義（P＞0．05）。經PCR-SSCP鑒定ALOX5有6種基因型，包括4/4、4/5、4/6、5/5、5/6和6/6；ALOX5基因多態性在漢族兒童中分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0．361，P＞0．05）。等位基因4及基因型（4/4+4/5）在病例組和對照組中分布差異均有統計學意義（均P＜0．05）。健康兒童ALOX5 mRNA表達量（0．20±0．14）顯著低于哮喘兒童（0．28±0．15）（P＜0．05）；基因型（4/4+4/5）個體ALOX5 mRNA表達量高于基因型（5/5+5/6）個體（P＜0．05），其余各基因型組間差異均無統計學意義（均P＞0．05）。 結論 ALOX5基因啟動子SP-1結合位點多態性可能與漢族兒童支氣管哮喘相關，該位點調控ALOX5 mRNA表達。

支氣管哮喘 ALOX5基因 單核苷酸多態性

支氣管哮喘是由遺傳和環境因素引起的下呼吸道慢性炎癥性失調。半胱胺酰白三烯（cys-LTs）是參與炎癥反應的關鍵介質，可引起支氣管阻塞、組織水腫、嗜酸粒細胞遷移和刺激氣道分泌增加。哮喘患者尿液、呼出氣體凝結物、痰和血清中均顯示cys-LTs水平顯著增高[1-4]。ALOX5基因編碼的花生四烯酸5-脂氧合酶（5-LO）是白三烯（LTs）和脂氧素（LXs）生成旁路的起始催化酶。在炎癥和過敏等疾病中5-LO表達通常升高，可能最終使cys-LTs類代謝產物增加。ALOX5基因啟動子區SP-1結合位點（-GGGCGG-）呈現一個插入/缺失多態性，野生型基因轉錄因子結合位點（-GGGCGG-）為5個（n=5），而突變型基因則增加1、2或3個鋅指結構或者減少1或2個鋅指結構（non-5），該多態性可引起5-LO表達的改變[5-6]，提示ALOX5基因啟動子區插入/缺失多態性可能與炎癥和過敏性疾病發生相關。

關于ALOX5基因啟動子區插入/缺失多態性與哮喘的關聯研究結果目前不盡相同[7-9]，可能主要由于不同人群基因型分布以及不同地區環境因素，研究樣本量大小等因素引起。此外，涉及漢族兒童的研究資料更是少見。

因此，本研究以支氣管哮喘漢族兒童為病例組，以健康漢族兒童為正常對照組，通過檢測兩組間等位基因頻率、基因型分布及不同基因型個體間ALOX5表達差異，旨在能夠初步闡明ALOX5基因啟動子區插入/缺失多態性與漢族兒童支氣管哮喘發生的關聯。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2010-08—2012-10在我院兒科急診、門診及住院的漢族患兒。依據2008年中華醫學會兒科學分會呼吸學組修訂的兒童哮喘防治常規[10]確診為支氣管哮喘的急性發作期兒童患者88例為病例組，年齡6個月～8歲，中位年齡3.2歲；其中男49例，女39例，病程6月～7年，中位數2.8年；選擇124例健康兒童為對照組，年齡在6個月～8歲，中位年齡3.2歲；其中男67例，女57例，無呼吸道及其它部位感染以及過敏反應史。各組均除外并發有呼吸衰竭、心力衰竭、先天性心臟病等明顯疾病患者；詳細記錄患者各項臨床資料。所有研究對象均對本研究知情同意，簽署知情同意書并獲得我院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 血標本收集及基因組DNA提取 采集全部對象清晨空腹靜脈血3ml，EDTA.K3抗凝，置-20℃冷凍備用。基因組DNA提取采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京TIANGEN BIOTECH），按照說明書進行操作，提取的DNA樣本采用紫外分光光度法（260/280比值）確定DNA的純度，OD260測定DNA的濃度。

1.2.2 PCR擴增 ALOX5基因擴增上游引物為5＇-AGGACCAGACACCTCGCTGAGGAGA GAC-3＇，下游引物為5＇-GAGCAGCGAGCGCCGGGAGCCTCGGC-3＇。反應體系為15μl，含50ng基因組DNA，10.0pmol每種引物，0.2mM每種單核苷酸，10×PCR緩沖液（50mM KCl，10mM Tris HCl和0.1%Triton X-100，1.5mM MgCl2和1.0U Taq酶）（大連TAKARA）。PCR擴增條件如下：95℃5min，（95℃ 30s，64℃ 30s，72℃ 40s）×40循環，72℃10min。

1.2.3 ALOX5基因型檢測 采用SSCP方法。配制10.0%丙烯酰胺凝膠，每個樣品用6×上樣緩沖液混合，最終上樣量為20μl，1×TAE為電泳緩沖液，以恒定電壓為60V電泳2.5h。電泳結束后，膠膜銀氨染色后用凝膠成像儀（美國BioRad）觀察條帶并保存圖像。電泳后可以產生的片段分別為255 bp（12bp缺失）、261bp（6bp缺失）、267bp（野生型）和273bp（6 bp插入），相對應于3、4、5和6個SP1結合位點。針對261 bp、267 bp和273 bp條帶分別回收凝膠，純化DNA后以ALOX5基因PCR擴增引物進行雙向測序進行基因型確認。

1.2.4 ALOX5 mRNA表達檢測 按照基因分型結果，在病例組中選擇4/4基因型9例，4/5基因型20例，5/5基因型20例和5/6基因型10例；在對照組中選擇4/4基因型9例，4/5基因型25例，5/5基因型25例和5/6基因型10例。用TRIzol（美國英維捷）提取全血總RNA，按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，EU）說明書操作合成cDNA。SYBR Green I實時熒光PCR檢測ALOX5 mRNA相對表達量，PCR擴增引物分別為：上游5＇-ACTGGAAACACGGCAAAAAC-3＇，下游5＇-TCACGGGGTAAATCCTTGTG-3＇；以β-actin基因作為內參照，上游5＇-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3＇，下游5＇-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3＇。PCR反應的循環參數為：95℃3min，（95℃10s，60℃45s）×40循環，60℃時收集熒光。根據2-ΔΔCt法來計算ALOX5 mRNA表達量[11]。

1.3 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件。正態分布的計量資料以表示，非正態分布的計量資料以中位數表示。Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗用χ2檢驗。病例組和對照組間性別、年齡以及基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。ALOX5 mRNA表達量兩組間比較采用t檢驗，3組間比較采用ANOVA檢驗。關聯分析用帶有95%可信區間（CI）的比值比（OR）表示。

2 結果

2.1 研究對象一般臨床特點 經過對各項資料分析，結果顯示有家族史、非母乳喂養、有過敏史和被動吸煙與兒童支氣管哮喘發病相關（P＜0.05），而在性別、年齡方面差異無統計學意義（P＞0.05）。哮喘患兒中有83.0%顯示過敏原陽性，其中吸入性過敏原陽性占絕大多數（81.4%），詳見表1。

表1 支氣管哮喘患兒和健康兒童一般臨床資料[例（%）]

2.2 ALOX5基因多態性在支氣管哮喘兒童組和健康兒童組中等位基因及基因型分布 經PCR-SSCP鑒定可見6種基因型，包括4/4、4/5、4/6、5/5、5/6和6/6；其中4/4、5/5和6/6條帶經膠回收、純化后測序確認，結果完全一致，見圖1。ALOX5基因多態性在漢族健康兒童和支氣管哮喘兒童中分布情況見表2，該基因等位基因頻率及基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.361，P＞0.05）。

由表2可見，等位基因4以及基因型（4/4+4/5）在病例和對照組中分布差異均有統計學意義（均P＜0.05）。2.3 ALOX5 mRNA表達量 ALOX5 mRNA在各組表達量見表3。健康兒童ALOX5 mRNA表達量（0.20±0.14）顯著低于哮喘兒童（0.28±0.15）（F=9.639，P＜0.05）；在病例組和對照組中，基因型（4/4+4/5）個體ALOX5 mRNA表達量均高于基因型（5/5+5/6）個體（F=4.194、5.178，均P＜0.05），其余各基因型組間比較均無明顯差異（均P＞0.05）。

圖1 ALOX5基因多態性鑒定 [A.ALOX5基因PCR-SSCP基因型結果（a：5/6基因型；b：5/5基因型；c：4/5基因型；d：4/4基因型；e：4/6基因型；f：6/6基因型）；B.ALOX5基因4/4基因型測序結果（對應于圖A中條帶d）；C.ALOX5基因5/5基因型測序結果（對應于圖A中條帶b）；D.ALOX5基因6/6基因型測序結果（對應于圖A中條帶f）]

表2 ALOX5基因多態性在支氣管哮喘兒童組和健康兒童組中分布[例（%）]

3 討論

兒童支氣管哮喘是西方發達國家最常見的兒童疾病之一，其在我國兒童人群中發病率約達3%，且近些年呈上升趨勢。哮喘是一種復雜的多基因疾病，同時受遺傳因素和環境因素的雙重影響。慢性呼吸道炎癥是兒童支氣管哮喘的典型特征之一，而且在哮喘患者血清、尿液和呼出氣體凝結物中LTs C4、D4和E4水平增高[1-4]。ALOX5是上述產物生物合成途徑中的首個催化酶，其基因啟動子區SP1結合位點缺失1個或2個（-GGGCGG-）序列可能減少ALOX5 mRNA表達[6]。國內外大量研究證實，在過敏性哮喘、運動性哮喘、阿司匹林哮喘患者中應用ALOX5抑制劑或白三烯受體拮抗劑可明顯緩解哮喘癥狀，提高患者肺功能水平[12-13]。

表3 ALOX5 mRNA表達量

本研究結果顯示ALOX5基因在漢族兒童中等位基因、基因型分布與韓國兒童基本相近，在我們的樣本中同樣未發現3等位基因，東亞黃種人5/5基因型分布低于白種人[8，14]，表明ALOX5基因多態性在人種間分布差異較大。通過關聯分析，我們發現攜帶等位基因4的漢族兒童發生支氣管哮喘的風險高于攜帶等位基因5個體（OR=1.600，95%CI：1.018～2.519），基因型（4/4+4/5）兒童發生支氣管哮喘的風險高于基因型5/5個體（OR= 1.903，95%CI：0.989～3.674）。在韓國學者的研究中，攜帶突變型（non-5）的阿司匹林不耐受哮喘（AIA）患者比野生型具有更嚴重的氣道高反應性，但并未顯示突變型是AIA的危險因素。Galván等[14]研究了西班牙人群中ALOX5基因啟動子SP-1結合位點多態性與哮喘的關聯，結果提示該位點與哮喘發生無關聯。造成以上這些矛盾結果，可能與人種、研究方案或樣本大小等因素有關。

本研究還分析了病例組、對照組以及不同基因型個體間全血ALOX5表達情況，結果發現健康兒童ALOX5 mRNA表達顯著低于哮喘兒童（P＜0.05）；無論是病例組還是對照組，基因型（4/4+4/5）個體表達ALOX5均高于基因型（5/5+5/6）個體（P＜0.05）。該結果表明ALOX5高表達與漢族兒童哮喘可能相關，同時提示ALOX5基因啟動子SP-1結合位點可能是一個能影響其表達的功能性位點。Vikman等[15]的研究也表明，在淋巴細胞中3、4等位基因與ALOX5基因高表達相關，通過分析ALOX5基因啟動子及第一內含子區域4個CpG島甲基化情況，發現差異性甲基化的CpG島位于ALOX5基因啟動子SP1結合位點內，進而調控ALOX5基因表達。

因此，本研究提示ALOX5基因啟動子SP-1結合位點多態性可能與漢族兒童支氣管哮喘相關，該位點能調控ALOX5 mRNA表達。

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Polymorphism of SP-1 binding motif in ALOX5 promoter may be associated with bronchial asthma susceptibility in Chinese Han children

Objective To investigate the association between polymorphism of SP-1 binding motif in ALOX5 promoter and bronchial asthma susceptibility in Chinese Han children． Methods Eighty-nine children with bronchial asthma(case group)and 124 healthy children (control group)were enrolled in the study．Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP)were applied to detect the polymorphism of ALOX5．Expression ALOX5 mRNA in peripheral blood was analyzed by real-time PCR in different genotypes of case and control groups． Results Clinical data revealed that family history,non-breastfeeding,history of allergies and passive smoking were the risk factors for bronchial asthma in Han children(P＜0．05)．Six genotypes of ALOX5 were identified by PCR-SSCP,including 4/4,4/5,4/6,5/5,5/6 and 6/6 genotypes．ALOX5 polymorphism in Han children was fitted with Hardy-Weinberg balance(χ2=0．361,P＞0．05)．The distributions of Allele 4 and genotypes(4/4+4/5)in the case and control groups showed significant differences(P＜0．05)．Relative expression levels of ALOX5 mRNA in healthy children(0．20±0．14)was significantly lower than that in asthmatic children(0．28±0．15)(P＜0．05)．The expression level of ALOX5 mRNA in genotypes(4/4+4/5)individuals was higher than those in genotypes(5/5+5/6)(P＜0．05)． Conclusion The polymorphism of SP-1 binding motif in ALOX5 promoter may be associated with the occurrence of bronchial asthma in Chinese Han children,which modulates ALOX5 mRNA expression．

Bronchial asthma ALOX5 gene Single nucleotide polymorphism

2014-05-22）

（本文編輯：田云鵬）

杭州市科技發展計劃項目（20110833B06）

310006 杭州市第一人民醫院兒科（劉占利、盛文彬、黃先玫、楊一華、馮亞男、黃暉、鄭緒陽），基因室（陳岳明）

盛文彬，E-mail：swb8825@163.com