抑制TUBA1C的過表達在卵巢癌細胞株CAOV3、SKOV3細胞增殖侵襲中的作用機制探討

江若安 葉楓 王新宇

抑制TUBA1C的過表達在卵巢癌細胞株CAOV3、SKOV3細胞增殖侵襲中的作用機制探討

江若安 葉楓 王新宇

目的探討抑制α-微管蛋白特異性1c鏈（TUBA1C）過表達對卵巢癌細胞株CAOV3、SKOV3細胞增殖、侵襲的影響，初步闡明TUBA1C在上皮性卵巢癌中的作用機制。方法 通過脂質體介導抑制TUBA1C基因的過表達質粒轉染CAOV3、SKOV3細胞，CAOV3分為3組：CAOV3實驗組、CAOV3空載體轉染組和CAOV3空白對照組；SKOV3分為3組：SKOV3實驗組、SKOV3空載體轉染組和SKOV3空白對照組。采用RT-PCR法檢測TUBA1C表達；CCK-8法及Transwell小室體外侵襲實驗評價TUBA1C基因抑制后對卵巢癌細胞增殖、侵襲的影響。結果 靶向TUBA1C基因的siRNA明顯、特異性地抑制TUBA1C mRNA的表達水平；培養72h CAOV3實驗組細胞增殖能力較空載體轉染組和空白對照組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0．05）；侵襲實驗結果提示SKOV3實驗組穿膜細胞數量為（0．95±0．12）個/視野，較空載體轉染組降低，差異有統計學意義（P＜0．01），CAOV3實驗組穿膜細胞數量為（1．13±0．14）個/視野，較空白對照組降低，但差異無統計學意義（P＞0．05）。結論 抑制TUBA1C基因過表達可抑制CAOV3、SKOV3細胞的增殖、侵襲能力，有望成為卵巢癌治療的新靶點。

TUBA1C 卵巢腫瘤 小分子干擾RNA 細胞增殖 腫瘤侵襲

卵巢癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，約90%為上皮性卵巢癌[1]，其中75%的病例在初診時已有腹腔內廣泛轉移。腫瘤侵襲和轉移與細胞運動能力密切相關，而決定細胞運動力的是由微管、微絲等構成的細胞骨架。微管是由α-微管蛋白和β-微管蛋白聚集而成的二聚體。既往較多研究集中于β-微管蛋白，且注重于其與紫杉醇的耐藥相關性上，而少有α-微管蛋白的研究。近來有研究發現α-微管蛋白在乳腺癌組織中較正常和癌前病變組織中表達顯著升高，并與患者的生存率相關[2]。已有少量前沿文獻提示α-微管蛋白在乳腺癌及肺癌等腫瘤中作用，鮮有α-微管蛋白與婦科腫瘤侵襲轉移相關性的研究。我們的前期研究中已確認在上皮性漿液性卵巢癌的蛋白質組學中發現α-微管蛋白特異性1c鏈（TUBA1C）在漿液性卵巢癌中表達上調[3]，因此認為TUBA1C與卵巢癌發生、發展、轉移關系密切。本文在此基礎上，運用RNA干擾技術，抑制卵巢癌細胞株CAOV3、SKOV3中的TUBA1C過表達，探討TUBA1C在上皮性卵巢癌轉移中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞分組 卵巢癌細胞株CAOV3分為3組：CAOV3實驗組、CAOV3空載體轉染組和CAOV3空白對照組。卵巢癌細胞株SKOV3分為3組：SKOV3實驗組、SKOV3空載體轉染組和SKOV3空白對照組。

1.2 主要試劑和儀器 （1）試劑材料：真核過表達及siRNA質粒由上海生博醫學生物工程科技有限公司提供；1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、Gibco及 Lipofectamine2000（trizol）由上海普飛生物公司提供；質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒（Qiagen）、一抗、二抗（Santa Cruz Biotechnology）由上海吉泰生物有限公司提供；E.coli DH-5α由浙江省女性生殖健康研究重點實驗室提供；2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽（CCK-8）由上海生工提供；Taq酶、dNTP、sybrgreen和逆轉錄酶（takara）由杭州浩嘉代理提供。（2）實驗室儀器：蛋白電泳儀及Real time PCR儀（CFX96）由美國bio-rad公司制造；流式細胞儀由美國BD公司制造；分光光度計（nanodrop 1000）由美國Thermo Fisher Scientific公司制造；CO2培養箱（MCO-17AIC）由日本三洋公司制造；超低溫冰箱由美國NBS公司制造；高速冷凍離心機（5817R）及常溫離心機（5814）由美國eppendorf公司制造；倒置顯微鏡由日本Olimpus公司制造；純水儀由美國Millipore公司制造。

1.3 實驗步驟和方法

1.3.1 細胞培養及轉染 卵巢癌CAOV3、SKOV3細胞常規培養于RPMI 1640培養基中，置于37℃、飽和濕度5%CO2孵箱中無菌培養。轉染前24h種板，待細胞融合度達90%～95%進行轉染。轉染前1～2h棄掉培養基，加入2ml不含血清的opti-MEM培養基（不含雙抗）混懸Lipofectamine 2000及siRNA，轉染4～6h后換成含雙抗和血清的RPMI 1640完全培養基繼續孵育；轉染24h后加入最適篩選濃度的G418，每3d更換1次含有G418的完全培養基。培養10d后，使用G418的維持濃度繼續培養15d。轉染后以RT-PCR檢測轉染效果。

1.3.2 CCK-8法檢測TUBA1C基因對CAOV3、SKOV3細胞增殖的影響 分組同1.1，處理同1.3.1。轉染成功后，分別于24、48和72h終止培養，加入CCK-8（5mg/ ml）10μl，繼續孵育0.5～4h后吸盡孔內液體，在450nm測定吸光度，讀取各孔光密度（D）值并計算增殖抑制率，最后繪制增殖曲線圖。增殖抑制率（%）=（各空白對照組D值-相應實驗組D值）/相應空白對照組D值×100%。

1.3.3 Transwell法檢測CAOV3、SKOV3細胞侵襲 分組同1.1，處理同1.3.1。以Matrigel膠均勻平鋪于Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜上模擬人工基底膜。轉染后6h消化，離心重懸細胞待用。將已處理的各組細胞懸液接種至Transwell小室內，將小室放入含趨化因子及培養液的24孔板，37℃、5%CO2條件下孵育24h后顯微鏡下觀察膜下不同的5個高倍視野，計數穿膜細胞數。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以示，組間比較進行方差分析，進一步兩兩比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測TUBA1C基因抑制效率 見表1。

表1RT-PCR檢測CAOV3、SKOV3中TUBA1C mRNA表達

TUBA1C基因干擾效率在CAOV3、SKOV3細胞中分別為58.8%及45.2%，CAOV3及SKOV3實驗組基因表達分別與CAOV3、SKOV3空載體轉染組及CAOV3、SKOV3空白對照組差異均有統計學意義（均P＜0.05）。而空載體轉染組和空白對照組相比，TUBA1C表達差異無統計學意義（P＞0.05），可排除非特異性基因沉默。2.2 CCK-8法檢測TUBA1C基因抑制后細胞增殖 見圖1-2。

由圖1可見，培養24h時CAOV3實驗組細胞增殖率為0.180±0.003，CAOV3空載體轉染組細胞增殖率為0.219±0.004，CAOV3空白對照組細胞增殖率為0.165± 0.002；培養48h時CAOV3實驗組細胞增殖率為0.198± 0.002，CAOV3空載體轉染組細胞增殖率為0.229±0.015，CAOV3空白對照組細胞增殖率為0.166±0.001；培養72h時CAOV3實驗組細胞增殖率為0.208±0.011，而CAOV3空載體轉染組及CAOV3空白對照組細胞增殖率分別為0.299±0.001及0.286±0.005，差異有統計學意義（P＜0.05）。

由圖2可見，培養24h時SKOV3實驗組細胞增殖率為0.160±0.002，SKOV3空載體轉染組細胞增殖率為0.163±0.005，SKOV3空白對照組細胞增殖率為0.168± 0.003；培養48h時SKOV3實驗組細胞增殖率為0.203± 0.009，SKOV3空載體轉染組細胞增殖率為 0.177± 0.002，SKOV3空白對照組細胞增殖率為0.181±0.001；培養72h時SKOV3實驗組細胞增殖率為0.185±0.004，SKOV3空載體轉染組細胞增殖率為 0.196±0.003，SKOV3空白對照組細胞增殖率為0.197±0.001。差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.3 Transwell小室體外侵襲實驗檢測TUBA1C基因抑制后各組細胞侵襲能力 見圖3-4。

圖1 TUBA1C抑制后CAOV3細胞增殖曲線（注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與空載體轉染組比較，▲P＜0.05）

圖2 TUBA1C抑制后SKOV3細胞增殖曲線

圖3 Transwell侵襲小室檢測 CAOV3細胞的侵襲能力（A：CAOV3空載體轉染組；B：CAOV3實驗組；HE染色，×200）

圖4 Transwell侵襲小室檢測 SKOV3細胞的侵襲能力（A：SKOV3空載體轉染組；B：SKOV3實驗組；HE染色，×200）

由圖3可見，CAOV3實驗組穿膜細胞數量為（1.13±0.14）個/視野，較CAOV3空載體轉染組降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

由圖4可見，SKOV3實驗組穿膜細胞數量為（0.95±0.12）個/視野，較SKOV3空載體轉染組降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 討論

對于微管蛋白的研究，既往較多研究集中于β-微管蛋白，發現多種腫瘤中β-微管蛋白的表達異常，并與抗腫瘤藥物的耐受性有關。近年來逐漸有學者開始對α-微管蛋白在多種腫瘤發生機制進行研究。

應榮彪等[3]發現α、β-微管蛋白的表達在乳腺正常組織、乳腺非典型增生組織、乳腺導管內癌組織和浸潤性癌組織中呈逐漸增高趨勢，認為乳腺癌前病變中已有中心體α、β-微管蛋白的過表達，得出α、β-微管蛋白的過表達可能在促使細胞過度增殖惡性轉化的過程中起到重要作用。陳清勇等[4]通過采用免疫組化及Western blot方法檢測α-微管蛋白和多耐藥基因1（MDR1）的在原發性非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達，發現α-微管蛋白在Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期NSCLC中的陽性表達率差異有統計學意義（P＜0.01），多因素生存分析認為α-微管蛋白（RR=3.287，P=0.006）可作為獨立的預后指標，從而得出α-微管蛋白在肺癌的發生和惡性進展中有一定作用的結論。此外，呂玉宇等[5]通過探討α、β、γ-微管蛋白在人鱗狀上皮宮頸永生化細胞（H8細胞株）和癌細胞（Caski細胞株）的表達差異，發現α、β、γ-微管蛋白，Caski細胞中的表達量高于H8細胞，從而認為中心體α、β、γ-微管蛋白異常可能是宮頸癌細胞惡性表型的特征之一。

而對于TUBA1C的研究尚少，目前僅有少量文獻報道其在骨腫瘤細胞中的相關研究。Li等[6]利用比較蛋白質組學分析法發現，與良性骨腫瘤相比，骨肉瘤組織有數個相關蛋白表達上調，其中就包括TUBA1C，表明這些被發現的蛋白包括TUBA1C在骨肉瘤的發生和治療中可能是潛在的生物標記物，在骨肉瘤中異常表達的細胞骨架微管相關蛋白，通過影響微管的穩定性，影響腫瘤的浸潤和轉移,從而影響患者的預后。而Li等[7]首次報道在上皮性漿液性卵巢癌的蛋白質組學研究中發現TUBA1C在漿液性卵巢癌中表達上調，為研究TUBA1C在婦科腫瘤，特別是上皮性卵巢癌發生、發展過程中的機制開啟了新的篇章。

腫瘤細胞運動能力增強可促進其穿過基底膜向鄰近組織甚至遠處轉移，與腫瘤的惡性程度有關。本實驗發現予TUBA1C抑制后，癌細胞株增殖及侵襲能力可能也受到影響，證實了TUBA1C的下調能降低卵巢癌細胞體外增殖能力及侵襲能力，抑制腫瘤細胞的惡性表型，TUBA1C有望成為卵巢癌抗腫瘤藥物耐受、基因治療的新靶點。

目前臨床上對卵巢癌的診治原則是早期發現，早期手術，輔以放化療和綜合支持治療，晚期以改善患者的生存質量為首要目的。TUBA1C作為腫瘤轉移機制的重要參與者，可以作為無損傷性腫瘤篩查的指標，在治療方面，探討TUBA1C與抗腫瘤藥物之間的作用機制，從基因啟動到信號轉導途徑進行干預，可能將有效地降低腫瘤的生物學惡性程度，延長患者的生存時間，提高其生存質量。

[1]Auersbergs N,Wong A S,Choi K C,et al．Ovarian surface epithelium:biology,endocrinology,andpathology[J]．EndocrRev,2001, 22（2）:255-288．

[2]Niu Y,Liu T,Tse G M,et al．Increased expression of centrosomal alpha,gamma-tubulin in atypical ductal hyperplasia and carcinoma of the breast[J]．Cancer Sci,2009,100（4）:580-587．

[3]應榮彪,馮俊,李建軍,等．α、β-微管蛋白在乳腺癌變不同階段的表達及意義[J]．中國癌癥雜志,2011,21(8):595-598．

[4]陳清勇,江中勇,吳麗君,等．α-微管蛋白和多藥耐藥基因1表達與肺癌生物學特性的相關性[J]．中華腫瘤雜志,2010,32(4):278-282．

[5]呂玉宇,趙涌,巫靜嫻,等．宮頸永生化細胞和癌細胞的α、β、γ-微管蛋白比較分析[J]．重慶醫科大學學報,2008,33(12):1471-1474．

[6]Li Y,Liang Q,Wen Y Q,et al．Comparative proteomics analysis of human osteosarcomas and benign tumor of bone[J]．Cancer Genet Cytogenet,2010,198(2):97-106．

[7]Li Y L,Ye F,Hu Y,et al．Identification of suitable reference genes for gene expression studies of human serous ovarian cancer by real-time polymerase chain reaction[J]．Anal Biochem,2010,394 (1):110-116．

Silencing over-expression of TUBA1C inhibits proliferation and invasion of human ovarian carcinoma CAOV3,SKOV3 cells

ObjectiveTo investigate the effect of silencing the over-expression of alpha-tubulin specific 1c chain(TUBA1C)gene on the proliferation and invasion of human ovarian carcinoma CAOV3 and SKOV3 cells． Methods TUBAIC sequencing-targeting siRNA was transfected into human ovarian carcinoma CAOV3 and SKOV3 cells．The expressions of TUBAICmRNA was examined by RT-PCR,the proliferation and invasion ability of CAOV3 and SKOV3 cells were evaluated by CCK-8 assay and Transwell assay,respectively．Results The TUBA1C sequence-specific siRNA effectively and specifically down-regulated the expression of TUBA1CmRNA．The CCK-8 results showed that the proliferation of cultured CAOV3 cells in experimental was significantly inhibited compared with those in control and negative transfection groups(P＜0．05)．The penetrating capacity of SKOV3 cells in the experimental group(0．95±0．12 cells/field)was significantly inhibited compared with those in the negative group(P＜0．01);however there was no significant differnce in CAOV3 cells between experimental group and negative group．Conclusion Silencing TUBA1C can effectively inhibit the proliferation and invasion of human ovarian carcinoma CAOV3 and SKOV3 cells,suggesting TUBA1C gene may be a potential new target for treatment of ovarian carcinoma．

TUBA1C Ovarian tumors Small interfering RNA Cell proliferation Neoplasm invasiveness

2013-05-20）

（本文編輯：楊麗）

浙江省衛生廳一般項目（2010KYA127）

310009 杭州，浙江大學醫學院附屬婦產科醫院腫瘤科

王新宇，E-mail：Wangxy@zju.edu.cn