CK19在口腔鱗狀細胞癌轉移淋巴結中的表達研究

徐加杰 葛明華 譚卓 方銑華 朱欣 鄭傳銘 王可敬 陳超 賞金標

CK19在口腔鱗狀細胞癌轉移淋巴結中的表達研究

徐加杰 葛明華 譚卓 方銑華 朱欣 鄭傳銘 王可敬 陳超 賞金標

目的檢測口腔鱗狀細胞癌（OSCC）患者淋巴結標本中細胞角蛋白19（CK19）的表達情況，尋找發現OSCC淋巴結轉移及微轉移的有效分子生物學手段。 方法 應用熒光定量RT-PCR檢測8例OSCC患者的119枚淋巴結標本中CK19 mRNA表達水平，并與HE染色及免疫組化進行比較。 結果 HE染色及免疫組化同時檢測到CK19陽性淋巴結24枚，熒光定量RT-PCR檢測到CK19陽性者48枚，HE染色及免疫組化結果CK19陰性而定量RT-PCR陽性的微轉移淋巴結主要分布于頸Ⅱ區。淋巴結總體微轉移率為20．17%。熒光定量RT-PCR檢測的CK19陽性淋巴結與HE染色及免疫組化比較有統計學差異（χ2=22．04，P＜0．01）。 結論 對于OSCC淋巴結轉移與微轉移的檢測，熒光定量RT-PCR對CK19 mRNA的檢測較HE染色和免疫組化敏感，分子病理檢測方法的應用可以有助于腫瘤的分期判斷、預后評估及治療方案的抉擇。

口腔腫瘤 鱗狀細胞癌 淋巴結微轉移 PCR 基因表達

口腔頜面部惡性腫瘤占全身惡性腫瘤的3.0%～4.0%，其中以口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）為主，占口腔頜面部惡性腫瘤80.0%以上。OSCC的淋巴結轉移和微轉移是其復發和轉移的基礎之一[1]。微轉移是指非血液系統惡性腫瘤在發展過程中，散播并存活于淋巴系統、血液系統及骨髓、肝、肺等器官中的癌細胞灶，可以是以單個癌細胞或獨立的癌細胞灶為單位，臨床上無特征性表現，病理檢查可為陰性。頸部淋巴結轉移被認為是OSCC預后的獨立影響因素，判斷淋巴結有無轉移對了解病情、估計預后和輔助治療有重要作用，但常規病理學及影像學方法難以發現和檢測某些隱匿性的微轉移癌細胞。目前研究認為檢測頭頸部腫瘤患者外周血細胞角蛋白（cytokeratin,CK）表達有助于監測微轉移的發生。本研究檢測了OSCC患者頸部淋巴結中CK19的表達情況并分析其臨床意義，旨在為早期發現OSCC淋巴結微轉移提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2007—2008年我院就診的8例OSCC患者的淋巴結標本共119枚，其中男6例，女2例，年齡32～69歲，中位年齡55歲?；颊邽樵l或短期復發OSCC，均未行放化療。按2010年美國AJCC唇癌和口腔癌TNM分期系統進行病理分期，其中Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～ⅣA期4例；高分化5例，高中分化3例；TNM分期：T1N0M0期 3例，T1N1M0、T2N0M0、T2N1M0、T2N2bM0、T4aN2bM0期各1例，術后1h內按照不同區域分離頸部淋巴結，分別取得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ區淋巴結數枚。將淋巴結編號并縱向剖開，其中一半制成5μm連續薄切片，分別行常規HE染色和免疫組化染色；另一半提取mRNA，行熒光定量RT-PCR檢測CK19 mRNA表達。標本獲取過程嚴格遵守無瘤原則，所有患者都進行術前告知及標本入庫告知?；颊唠S訪截止至2012年4月，隨訪時間6～62個月，平均39.4個月。

1.2 主要儀器和試劑 鼠抗人CK19單克隆抗體、抗原阻斷劑、辣根過氧化物酶購自丹麥Dako公司，兔/鼠雙標生物素化抗體(EnVisionTMplus試劑盒）購自美國Maxim Biotech公司，Trizol試劑以及引物購自美國Invitrogen公司。CK19引物序列：上游5′-ACCAAGTTTGAGACGGAACAG-3′，下游5′-CCCTCAGCGTACTGATTTCCT-3′。逆轉錄試劑盒Prime SciptTMRT reagent Kit購自日本TaKaRa公司，熒光定量PCR試劑盒BioEasy SYBR Green I PCR Kit購自杭州博日公司，Applied Biosystems Prism 7500熒光定量PCR為美國ABI公司產品。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 標本經脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫液抗原修復10min。以鼠抗人CK19單克隆抗體為一抗，兔/鼠雙標生物素化抗體為二抗，行免疫組化SP法染色。陽性判斷標準是：轉移淋巴結中CK19表達位于細胞質，鏡下觀察細胞質呈棕黃色，細胞核為藍色（見圖1B）。

1.3.2 熒光定量RT-PCR檢測 取100mg淋巴結組織標本，Trizol法提取總RNA，每個樣本設2個平行管，使用逆轉錄試劑盒Prime SciptTMRT reagent Kit進行逆轉錄。PCR反應在Applied Biosystems Prism 7500熒光定量PCR儀上進行，條件如下：95℃預變性3 min，95℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環后72℃再延伸10 min。對PCR產物均進行熔解曲線實驗，以評價PCR反應的特異性。條件如下：95℃ 15s，60℃20s，然后在20 min內緩慢升溫至95℃。同時設置陰性及陽性對照。將標準品貯存液（2×106拷貝/μl）梯度稀釋為 2×105、2×104、2×103、2×102、2×101拷貝/μl，分別取5μl與待測樣品同時進行PCR擴增，制作標準定量曲線。標準曲線的直線回歸相關系數R2=0.99，斜率為-2.99。標準曲線計算公式為：Y（檢測樣本起始模板濃度的對數值）=-2.9932X（檢測樣本的Ct值）+41.28。根據各檢測樣本Ct值與標準曲線計算各樣品中CK19 cDNA的初始表達量。

1.3.3 淋巴結微轉移判定方法 常規HE染色和免疫組化染色陰性而RT-PCR檢測CK19陽性的淋巴結判斷為微轉移淋巴結。RT-PCR檢測CK19陽性判斷標準為：CK19拷貝＞1×104拷貝/μl。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件，計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 患者頸淋巴結HE染色與免疫組化結果 8例患者頸淋巴結的HE染色與相應的CK19免疫組化染色的陽性率無差異，均為20.17%（24/119），并呈一一對應，見圖1。

圖1 患者頸淋巴結連續切片的HE染色和免疫組化染色（A：轉移淋巴結，HE染色；B：與A同一轉移淋巴結，免疫組化SP法染色；C：非轉移淋巴結，HE染色；D：與C同一非轉移淋巴結，免疫組化SP法染色，×200）

2.2 熒光定量RT-PCR檢測患者淋巴結CK19 mRNA的表達 熒光定量RT-PCR檢測中樣品的2個平行管實時熒光值擬合良好，表明PCR反應體系穩定，模板分配均勻，結果可靠。結果顯示HE和CK19免疫組化染色均陽性的24枚淋巴結中，CK19 mRNA表達也呈陽性；而HE和CK19免疫組化染色均陰性的95枚淋巴結中，24枚CK19 mRNA表達陽性，微轉移率為20.17%。熒光定量RT-PCR檢測CK19 mRNA的陽性表達與HE染色及免疫組化檢測比較有統計學差異（χ2=22.04，P＜0.01）。基于HE染色、免疫組化以及熒光定量RT-PCR檢測，將所有淋巴結分成HE染色和免疫組化陽性/PCR陽性組（A組）、微轉移陽性組（B組）、HE染色和免疫組化陰性/ PCR陰性組（C組）。T2期、T4期微轉移陽性淋巴結所占比例高于T1期（χ2=7.06，P＜0.05），見表1。

表1 不同分期患者淋巴結分組特征[例（%）]

2.3 熒光定量RT-PCR檢測淋巴結CK19 mRNA表達對患者腫瘤分期及預后的影響 根據熒光定量RTPCR檢測結果對術后腫瘤分期進行重新評估，淋巴結微轉移的情況主要發生在Ⅱ區，Ⅱ區中HE染色和免疫組化陽性淋巴結與微轉移陽性淋巴結顯著高于其他區域，Ⅱ區微轉移陽性淋巴結占所有陽性淋巴結比例最高，見圖2。8例患者共30個頸淋巴結區域中有10個區域檢出微轉移陽性淋巴結（10/30），而有9個淋巴結區域HE染色和免疫組化檢測為陽性（9/30），熒光定量RT-PCR檢測結果與HE染色和免疫組化檢測具有高度相關性（r=0.929，P＜0.01）。

而從術后病情的轉歸來看，微轉移陽性組的患者與微轉移陰性組的患者預后截然不同，微轉移陽性組患者均出現淋巴結復發，而微轉移陰性組均未出現淋巴結復發，1例患者因局部復發死亡，見表2。

圖2 患者各淋巴結區域HE染色和免疫組化陽性淋巴結與微轉移淋巴結比例

表2 CK19淋巴結微轉移的區域分布及患者預后

3 討論

自1896年在外周血中首次發現癌細胞，腫瘤微轉移的概念在臨床治療和基礎研究中逐步建立起來。微轉移是指非血液系統惡性腫瘤在發展過程中，散播并存活于淋巴系統、血液系統等組織及骨髓、肝、肺等器官中的癌細胞灶，可以是以單個癌細胞或獨立的癌細胞灶為單位，尚無特殊血供，臨床上無特征性表現。Hamakawa等[2]指出TNM分期中N0期患者中多發的淋巴結微轉移灶，可能反映了原發腫瘤具有較活躍的轉移活性。一般認為微轉移是淋巴結轉移的早期階段，可能進一步發展成為病理陽性淋巴結，但對于如何評估淋巴結微轉移對患者預后的影響目前尚有爭議。目前淋巴結微轉移的理論支持主要有：微量癌細胞自原發灶脫落-局部生長-進入淋巴系統-免疫逃避-癌細胞被正常淋巴結“捕獲”-適應新環境-微血管形成-腫瘤生長。微轉移灶癌細胞可長期處于G0期或處于細胞增殖與凋亡的平衡狀態，當機體遭受打擊或免疫力下降時，休眠的癌細胞擺脫抑制狀態而持續增殖，最終發展為臨床轉移，病理陽性淋巴結可能是微轉移淋巴結的晚期階段[3]。

Stoeckli等[4]根據轉移灶的直徑對口腔及口咽部鱗癌的微轉移進行研究，提示32.0%的患者出現以單個或成簇的癌細胞為表現形式的頸淋巴結微轉移，認為雖然這些微轉移淋巴結對臨床預后的判斷尚未完全定論，但這樣的評估對于患者而言仍舊是重要的。淋巴結微轉移說明癌細胞已發生擴散，可能是不良預后的重要指標。如何對這類患者進行綜合治療提高治愈率是不可忽視的，因為這有可能導致對腫瘤病理分期的重新評估。王洲等[5]進行了N0期食管癌術后早期復發與淋巴結微轉移的相關性研究，發現18例患者26枚淋巴結微轉移,分期由Ⅰ～ⅡA期提升為ⅡB～Ⅲ期，結果顯示根治性切除后的pN0期食管癌患者的腫瘤早期復發與淋巴結微轉移有關。同樣，根據RT-PCR檢測CK19 mRNA的結果，本研究中病例3的腫瘤病理分期直接從Ⅰ期轉變為Ⅲ期，可直接導致了其治療模式的改變（單純手術→手術+術后放療）。同時，本研究還發現OSCC淋巴結微轉移的情況主要發生在Ⅱ區，這可能和口腔的淋巴結引流途徑有關[2]，RT-PCR淋巴結微轉移的發生和該區域存在陽性淋巴結具有相關性。這個證據提示從原發灶到區域淋巴結的轉移過程可能是一個多發的、有時間順序的行為，轉移時間的早晚和發展的快慢造成了該區域內淋巴結轉移情況的不同，淋巴結微轉移灶可通過不同途徑在不同時間發展為淋巴結臨床轉移。所以如果能夠早期發現患者的淋巴結微轉移病灶，有利于及時調整治療策略，幫助患者獲得更好的預后。

CK是一種7～11 mm的間質絲，是正常上皮細胞和腫瘤組織中細胞形成的主要間質成分。對于CK的檢測，免疫組化可以彌補常規染色依靠細胞形態特點確診的缺陷。Xu等[6]的研究顯示CK19在淋巴結陽性的病例中檢出率為100.0%,并且認為檢測頭頸部腫瘤患者外周血中CK mRNA的表達有助于監測微轉移的發生。同時，Parikh等[7]對乳腺癌的研究也發現CK19可作為檢測微轉移的一項獨立指標。到目前為止，應用免疫組化的方法檢測CK或CK19已成為OSCC淋巴結病理檢測中的重要檢測方法之一。

對于OSCC而言，頸部淋巴結轉移往往意味著預后不良，也決定著術后是否需要采取輔助性治療措施（如放療和/或化療等）。臨床上發現術后病理淋巴結陰性的患者約5.0%～10.0%會出現頸部淋巴結復發，但HE染色法在檢測微轉移灶，特別是單細胞轉移灶上存在一定的難度，即便是顯色良好的免疫組化也可能存在漏檢的情況，而且受制片及閱片醫師經驗的限制，免疫組化檢測質控標準難以穩定。目前熒光定量RT-PCR檢測可以絕對定量，利用熒光定量RT-PCR檢測OSCC淋巴結微轉移具有高靈敏度的特點，但也存在具有假陽性較高的缺陷，重復設置樣本及合適的閾值有助于減少假陽性的產生[8]，本研究中每個樣本均設置了兩個平行管進行檢測，將CK19表達陽性判斷標準設為拷貝數＞1×104拷貝/μl，同時在取材時盡可能保證獲取的組織為淋巴組織，剔除淋巴結包膜及周邊多余的結締組織。在頭頸部鱗癌中，常規石蠟切片檢查可能遺漏頸淋巴結微轉移，0.5mm直徑的微轉移灶被檢出可能性只有11.0%，0.2mm直徑的微轉移灶檢出的可能性僅為4.0%[9]。連續切片可以提高病理陽性淋巴結的檢出率，Eary等[10]報道在乳腺癌標本中連續切片對微轉移灶的檢出率比常規方法可以提高33.0%。雖然目前認為免疫組化處理后的常規切片在尋找微小轉移灶時具有直觀的優勢，但在連續薄切片情況下，本研究結果顯示HE染色和CK19免疫組化染色對病灶的檢測效能無明顯差別，而熒光定量RT-PCR檢測微轉移淋巴結的陽性檢出率更高。

OSCC是否存在淋巴結微轉移，對患者術后病情轉歸可能具有一定影響。本研究中，出現CK19 RT-PCR陽性的患者均出現術后淋巴結復發，提示淋巴結微轉移可能為OSCC術后淋巴結復發的高危因素。所以，筆者認為對OSCC術后標本中淋巴結CK19 RT-PCR陽性的患者應密切隨訪，以盡早發現患者癌灶的轉移及復發，使患者得到及時的治療。本研究所涉及的患者數量較少，尚需多中心、大樣本研究進一步證實。早期發現淋巴結微轉移并及時給予治療，這對減少OSCC術后遠處轉移及復發、爭取良好的預后、提高療效具有重要臨床意義。

[1]Marchant F E,Lowry L D,Moffit J J,et al．Current trends in posttreatment follow-up of patients with squamous cell carcinoma of the head and neck[J]．AmJOtolaryngol,1993,14(2):88-93．

[2]Hamakawa H,Takemura K,Sumida T,et al．Histological study on pNupgradingoforalcancer[J]．VirchowsArch,2000,437(2):116-121．[3]Raj G V,Moreno J G,Gomella L G．Utilization of polymerase chain reactiontechnologyinthedetectionofsolidtumors[J]．Cancer,1998, 82(8):1419-1442．

[4]Stoeckli S J,Pfaltz M,Steinert H,et al．Histopathological features of oecult metastasis detected by sentinel lymph node biopsy in oral andoropharygealsquamouscellcarcinoma[J]．Laryngoscope,2002, 112(1):111-115．

[5]王洲,劉相燕,劉凡英,等．N0期食管癌術后早期復發與淋巴結微轉移的相關性研究[J]．中華外科雜志,2004,42(2):68-71．

[6]Xu Y,Lefèvre M,Périé S,et al．Clinical significance of micrometastases detection in lymph nodes from head and neck squamous cell carcinoma[J]．Otolaryngol Head Neck Surg,2008, 139(3):436-441．

[7]Parikh R R,Yang Q,Higgins S A,et al．Outcomes in young women with breast cancer of triple-negat ive phenotype:the prognositic significance of CK19 mRNA expression[J]．Int J Radiat Oncol Biol Phys,2008,70(1):35-42．

[8]Shores C G,Yin X,Funkhouser W,et al．Clinical evaluation of a new molecular method for detection of micrometastases in head and neck squamous cell carcinoma[J]．Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2004,130(8):937-942．

[9]Becker M T,Shores C G,Yu K K,et al．Molecular assay to detect metastatic head and necksquamous cell carcinoma[J]．Arch Otolaryngol Head NeckSurg,2004,130(1):21-27．

[10]Eary J F,Mankoff D A,Dunnwald L K,et al．Sentinel lymph node mapping for breast cancer:Analysis in a diverse patient group [J]．Radiology,1999,213(2):526-529．

Expression of CK19 in metastatic lymph node from oral squamous cell carcinoma and its significance

ObjectiveTo evaluate the expression of CK19 in lymph nodes from oral squamous cell carcinoma and its clinical significance．Methods Expression of CK19 protein and mRNA was detected by immunohistochemistry and quantitative RT-PCR in 119 lymph nodes from 8 oral squamous cell carcinoma patients,and its relation to the metastasis detected by HE was analyzed．Results In 119 lymph nodes from 8 oral squamous cell carcinoma patients,31 positive lymph nodes were detected by HE staining and immunohistochemical staining of CK19,and 55 by quantitative RT-PCR．Micrometasis was detected in 24 out 119 lymph nodes with a micrometastatic rate of 20．17%． Conclusion Detection of CK19 mRNA expression with fluorescent quantitative RT-PCR is more sensitive for diagnosis of metastatic and micrometastatic lymph nodes,which would contribute to the re-evaluation of tumor staging and treatment．

Oral neoplasms Squamous cell carcinoma Lymph node micrometastasis PCR Gene expression

2012-09-20）

（本文編輯：胥昀）

國家自然科學基金青年科學基金項目（81202127）；浙江省衛生高層次創新人才培養工程項目（2008-134）；浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2010KYA033、2012KYA031、2013KYB033）

310022 杭州，浙江省腫瘤醫院頭頸外科（徐加杰、葛明華、譚卓、鄭傳銘、王可敬、陳超、賞金標），病理科（方銑華），浙江省腫瘤研究所（朱欣）

葛明華，E-mail:gemingh@163.com