蝎毒抗癌多肽對HL-60細胞凋亡及Bcl-2和p53基因表達的影響

莊海峰 鄭智茵 莊曉芬 周郁鴻 沈建平

蝎毒抗癌多肽對HL-60細胞凋亡及Bcl-2和p53基因表達的影響

莊海峰 鄭智茵 莊曉芬 周郁鴻 沈建平

目的研究蝎毒抗癌多肽（APBMV）在體外誘導人急性粒細胞白血病HL-60細胞凋亡的作用及其相關機制。 方法采用CCK-8法檢測APBMV作用后HL-60細胞的增殖抑制率，光鏡觀察APBMV作用后HL-60細胞的形態學變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Western blot檢測APBMV對相關凋亡基因蛋白表達的影響。 結果 CCK-8法顯示APBMV能夠抑制HL-60細胞增殖，其對HL-60細胞增殖的IC50為15．64μg/ml。流式細胞儀檢測提示APBMV能誘導HL-60細胞凋亡，且呈濃度-效應關系。APBMV（16μg/ml）作用48h后，細胞凋亡率為（36．1±2．1）%，與正常對照組比較有統計學差異（P＜0．05）。Western blot提示APBMV（4、8、12和16μg/ml)組的Bcl-2蛋白表達量分別為正常對照組的78．60%、54．60%、25．50%和4．20%；p53蛋白表達量分別為正常對照組的163．00%、271．00%、355．00%和447．00%。 結論 APBMV可有效抑制HL-60細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，其機制可能與促進HL-60細胞內p53基因的表達，抑制Bcl-2基因的表達有關。

蝎毒 HL-60 細胞凋亡 Bcl-2 p53

全蝎為鉗蝎科動物鉗蝎的干燥全蟲，中藥藥典中記載其具有清熱解毒，熄風止痙，祛風除濕之功效。河南醫科大學生物毒素中心利用分子篩層析技術進一步從東亞鉗蝎粗蝎毒中分離提取出了蝎毒抗癌多肽（APBMV）[1]，實驗證明APBMV對人乳腺癌MCF-7細胞[2]、前列腺癌DU145細胞[3]、卵巢癌3AO細胞[4]等腫瘤細胞具有抑制增殖及誘導凋亡的作用。本實驗通過體外實驗觀察APBMV對人急性粒細胞白血病細胞株HL-60的增殖與凋亡的作用并探討相關機制，為蝎毒抗癌新藥的開發利用提供一定的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器 HL-60細胞由浙江中醫藥大學中心實驗室提供，RPMI 1640培養液、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于杭州吉諾生物醫藥技術有限公司，BCA蛋白含量測定試劑盒、CCK-8試劑盒購于上海碧云天生物技術公司，Bcl-2鼠抗人單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，鼠抗IgG購于北京中杉金橋生物技術公司，吖啶橙（AO）為上海科興試劑公司產品。多功能酶標儀為美國Thermo Scientific公司產品，流式細胞儀為美國Bio-rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 HL-60細胞的復蘇及培養 HL-60細胞復蘇后，接種于20ml培養瓶中，37℃、5%CO2培養箱靜置培養，并行臺盼藍拒染實驗了解細胞活性。

1.2.2 CCK-8法檢測APBMV對HL-60細胞增殖的影響 稱取APBMV凍干粉5mg，加入5ml D-Hanks液，配制為1mg/ml的母液，12 000 r/min離心10min，取其上清液。使用前用D-Hanks液稀釋為4、8、12和16μg/ ml 4個濃度梯度。取對數生長期HL-60細胞，以（1～5）× 108/L的密度接種于96孔板，每孔體積200μl，每組設置3個復孔。分組：（1）溶劑對照組：加入等體積D-Hanks液；（2）實驗組：分別加入終濃度分別為4、8、12和16μg/ ml的APBMV；（3）正常對照組：不作任何處理。共培養48h后，每個孔內加入10μl CCK-8試劑，繼續培養1h。用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度OD值。分別計算細胞存活率和增殖抑制率，細胞存活率（%）=（實驗組OD值-溶劑對照組OD值/正常對照組OD值-溶劑對照組OD值）×100%，細胞增殖抑制率（%）=[1-（實驗組OD值-溶劑對照組OD值）（/正常對照組OD值-溶劑對照組OD值）]×100%。

1.2.3 APBMV作用后HL-60細胞形態學變化 配制濃度為1mg/ml的AO母液，臨用前稀釋為10μg/ml。取對數生長期HL-60細胞，以（1～5）×108/L密度接種于96孔培養板，分別加入不同濃度APBMV（4、8、12和16μg/ ml）20μl，每組各設3個平行孔，培養48h后每孔加入AO 1μl，孵育30min，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 APBMV對HL-60細胞凋亡的影響 細胞分組同上，收集培養48h的HL-60細胞，洗滌離心后調整細胞密度為（1～5）×105/L，先后加入5μl Annexin V-FITC和5μl碘化丙啶，混勻后室溫避光孵育10min，流式細胞儀檢測。

1.2.5 APBMV對HL-60細胞Bcl-2及p53蛋白表達的影響 細胞分組同上，4、8、12、16μg/ml APBMV作用48h后，分別收集各組細胞，提取蛋白質，上樣檢測，化學發光試劑顯色，膠片貼近曝光，顯影、定影后掃描分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用方差分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 APBMV對HL-60細胞的增殖抑制作用 APBMV對HL-60細胞具有增殖抑制作用，4μg/ml APBMV作用48h后，HL-60細胞活性為81.00%，增殖抑制率為19.00%；隨著藥物濃度的增加，抑制率逐漸增加，當藥物濃度為16μg/ml時，增殖抑制率為51.53%，不同濃度的APBMV組與正常對照組比較均有統計學差異（均P＜0.05）。APBMV對HL-60細胞增殖抑制的IC50為15.64μg/ml，見表1。

表1 不同濃度APBMV對HL-60細胞增殖的影響

2.2 APBMV誘導HL-60細胞凋亡的形態學觀察 光鏡下正常對照組HL-60細胞呈圓形或橢圓型，APBMV作用48h后，細胞出現凋亡形態學表現，細胞核碎裂，染色質凝集濃染，凋亡小體形成。實驗組（4、8、12和16μg/ml APBMV）細胞明顯減少，不同濃度APBMV均能抑制HL-60細胞增殖并誘導凋亡，隨著APBMV濃度增高，抑制作用也增強，凋亡細胞也相應增多（圖1，見插頁）。APBMV作用48h后，熒光顯微鏡下觀察可見活細胞核染色質呈現均勻的淡綠色熒光。凋亡細胞體積變小，胞核固縮、邊集或碎裂，呈現綠色熒光，并可見凋亡小體（圖2，見插頁）。

2.3 APBMV對HL-60細胞凋亡的影響 正常對照組HL-60細胞凋亡率為（2.5±0.7）%，4、8、12和16μg/ml APBMV作用48h后，細胞凋亡率分別為（9.5±1.2）%、（15.1±2.3）%、（24.3±1.9）%和（36.1±2.1）%，不同濃度實驗組與正常對照組比較均有統計學差異（均P＜0.05），說明APBMV能誘導HL-60細胞凋亡，并呈濃度-效應關系（圖3，見插頁）。

圖1不同濃度ABPMV作用后HL-60細胞形態學觀察（A：正常對照組；B：4μg/ml組；C：8μg/ml組；D：12μg/ml組；E：16μg/ml組；×200，無染色）

圖2 熒光顯微鏡下觀察不同濃度ABPMV作用后HL-60細胞形態學變化（A：正常對照組；B：4μg/ml組；C：8μg/ml組；D：12μg/ml組；E：16μg/ml組；×200，AO染色）

圖3 APBMV對HL-60細胞凋亡的影響（A：正常對照組；B：4μg/ml組；C：8μg/ml組；D：12μg/ml組；E：16μg/ml組）

2.4 APBMV對HL-60細胞Bcl-2和p53蛋白表達的影響 4、8、12和16μg/ml APBMV作用48h后，各實驗組HL-60細胞中Bcl-2蛋白表達量分別為正常對照組的78.60%、54.60%、25.50%、4.20%；p53蛋白表達量分別為正常對照組的163.00%、271.00%、355.00%和447.00%，不同濃度APBMV組與正常對照組比較均有統計學差異（均P＜0.05），見表2和圖4-5。

3 討論

APBMV并非單一成分的多肽，而是由4組帶有不同電荷或電量的多肽組成的混合多肽，既往研究已證實其對多種腫瘤細胞均有抑制增殖和誘導凋亡的作用[2-4]。本研究中CCK-8法檢測提示APBMV能夠抑制HL-60細胞增殖，同時經形態學觀察和流式細胞儀檢測證實APBMV能夠誘導HL-60細胞凋亡，且隨著APBMV濃度增加，抑制細胞增殖和誘導凋亡的能力也增強，抑制作用呈濃度依賴性。

細胞凋亡是生物體基本生命活動之一，與許多生物學過程和疾病的發生、發展有密切的關系。它的作用在于清除機體損傷、衰老或多余的細胞，是維持機體生長發育和自身組織穩定的重要生命現象。當衰老細胞不能通過凋亡機制予以清除時，便可能導致腫瘤發生[5]。Bcl-2、p53是兩個重要的細胞凋亡基因。作為凋亡抑制基因，Bcl-2可導致DNA受損的細胞持續存在，抑制其凋亡的發生，從而突變產物聚集，因此Bcl-2過度表達與多種腫瘤的發生密切相關[6-7]。p53基因是一種與人類腫瘤相關的抑癌基因[8-9]，被認為是細胞凋亡過程中不可缺少的重要基因之一。本研究發現，APBMV使HL-60細胞中抑癌基因p53蛋白表達上調，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下調，可能是蝎毒誘導細胞HL-60凋亡的分子基礎之一，但由于中藥制劑成分復雜，具體作用機制有待于深入研究和探索。

綜上所述，本研究提示APBMV能夠抑制HL-60增殖并誘導細胞凋亡，其機制可能與促使p53蛋白表達上調，Bcl-2表達下調有關。本研究結果可為蝎毒的臨床應用提供一定的生物學依據，也可為分離、提取其中的有效抗癌成分提供一定的理論依據。進一步的深入研究可從以下幾個方面展開：了解國內外對于APBMV的理論研究進展；進行動物實驗，進一步證實APBMV的抗腫瘤作用及其相關機制。

表2 APBMV對HL-60細胞Bcl-2和p53蛋白表達的影響

圖4 Western blot檢測HL-60細胞Bcl-2蛋白表達

圖5 Western blot檢測HL-60細胞p53蛋白表達

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Effect of anticancer polypeptide in scorpion venom on apoptosis and Bcl-2,p53 gene expression in human leukemia HL-60 cells

ObjectiveTo investigate the effect of antitumor polypeptide extracted from scorpion venom (APBMV)on apoptosis and Bcl-2,p53 gene expression in human leukemia HL-60 cells．Methods APBMV was separated and purified by column chromatography with SephadexG-50,and analyzed by HPLC method．The cultured HL-60 cells were treated with different concentrations of APBMV．The cell growth was assayed by CCK-8 method;the morphological changes of HL-60 cells was observe by microscope,cell apoptosis was measured by flow cytometry,the expression of Bcl-2 and p53 genes was detected by Western blot．Results CCK-8 demonstrated that APBMV restrained HL-60 cells multiplication in a dose-effect manner with a IC50of 15．64μg/ml．Flow cytometer showed that APBMV induced HL-60 cells apoptosis in a dose-effect manner;with APBMV (16μg/ml)for 48h,the apoptosis rate of HL-60 cells was(36．1±2．1)%,significantly higher than that of control group．Western blot showed that APBMV down-regulated the expression of Bcl-2 protein and up-regulated expression of p53 protein．Conclusion APBMV can effectively inhibit the proliferation and induce apoptosis of HL-60 cells,which are associated with up-regulation of p53 and down-regulation of Bcl-2 genes．

Scorpion Venom HL-60 Apoptosis Bcl-2 P53

2013-11-26）

（本文編輯：胥昀）

310006 杭州，浙江中醫藥大學附屬第一醫院血液科

沈建平，E-mail：sjping88@163.com