瘦素對(duì)大鼠肝纖維化星狀細(xì)胞的作用及相關(guān)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

周光耀 金玲湘 林巍 潘陳為 諸葛璐 方佩佩

瘦素對(duì)大鼠肝纖維化星狀細(xì)胞的作用及相關(guān)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

周光耀 金玲湘 林巍 潘陳為 諸葛璐 方佩佩

目的探討瘦素（leptin）對(duì)大鼠肝纖維化星狀細(xì)胞（HSC）的作用及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法 采用改良原位灌注、Optiprep密度梯度離心法分離純化大鼠HSC。通過臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞存活率，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）免疫組化鑒定，光鏡觀察形態(tài)學(xué)變化。將40只SD大鼠分為4個(gè)處理組：對(duì)照組、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）組（加入10-7mol/L AngⅡ）、Leptin組（加入100ng/ml Leptin）、Leptin+AngⅡ組（加入100ng/ml Leptin+10-7mol/L AngⅡ）。分別采用3H-TdR和3H-Pro摻入法進(jìn)行HSC增殖和膠原合成的測(cè)定。Western blot檢測(cè)各處理組p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 大鼠HSC存活率＞90%，傳代1次后HSC純度＞95%。與對(duì)照組相比，AngⅡ組、Leptin組、Leptin+AngⅡ組的HSC增殖和膠原合成均明顯增加（均P＜0．05）；與AngⅡ組、Leptin組相比，Leptin+AngⅡ組HSC增殖和膠原合成明顯增加（均P＜0．05）。Western blot顯示，AngⅡ組、Leptin組、Leptin+AngⅡ組的p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白水平均較對(duì)照組明顯升高（均P＜0．05）；與AngⅡ組、Leptin組相比，Leptin+AngⅡ組p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白水平明顯升高（均P＜0．05）。 結(jié)論 瘦素可通過上調(diào)AngⅡ水平，激活ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激HSC增殖和膠原合成，導(dǎo)致肝纖維化。

瘦素 肝纖維化 HSC ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是肝臟纖維組織過 度積聚的過程，其病理基礎(chǔ)是肝細(xì)胞變性、壞死[1-2]。近年來(lái)研究表明，瘦素（leptin）水平與HF的發(fā)生、發(fā)展有著密切的相關(guān)性[3-4]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路是多種細(xì)胞生理過程的重要信號(hào)調(diào)節(jié)途徑。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1/2是MAPK家族的一員，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育等信號(hào)的網(wǎng)絡(luò)核心。有研究表明，AngⅡ表達(dá)增高能夠激活NAD（P）H氧化酶誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，從而進(jìn)一步激活MAPK等通路而調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的增殖和遷移[5]。本研究試圖探討瘦素對(duì)大鼠HSC的作用及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重（250±20）g；購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)［SCXK-（軍）2007-004］。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為4個(gè)處理組：對(duì)照組、血管緊張素Ⅱ組（10-7mol/L AngⅡ）、Leptin組（100ng/ml Leptin）、Leptin+AngⅡ組（100ng/ml Leptin+10-7mol/L AngⅡ），每組各10只。各組大鼠分離純化HSC并培養(yǎng)24h，分別加入不同處理因素共同培養(yǎng)48h后，進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.2 主要試劑及儀器 鏈霉蛋白酶E、Ⅳ型膠原酶、DNA酶Ⅰ、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）單克隆抗體（1∶1 000）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；小鼠抗大鼠p-ERK、ERK、AngⅡ單克隆抗體，羊抗兔和羊抗小鼠抗體均為美國(guó)Bio-RAD公司產(chǎn)品；Optiprep密度梯度液購(gòu)于挪威Axisshield公司；免疫組化二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中山金橋公司。3H-胸腺嘧啶（3H-TdR）和3H-脯氨酸（3H-Pro）購(gòu)自中國(guó)原子能研究院同位素研究所。AngⅡELISA試劑盒及Leptin ELISA試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Uscn公司；PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒為上海碧云天公司產(chǎn)品；Axiovert 200倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Carl Zesis公司；電泳系統(tǒng)及凝膠成像系儀均為美國(guó)Bio-RAD公司產(chǎn)品。

1.3 分離培養(yǎng)液的配制 前灌注液（包括0.5mmol/L EGTA、20mmol/L Hepes、以及0.2mol肝素鈉的100ml DHanks液）、鏈霉蛋白酶E灌注液（將15mg鏈霉蛋白酶E溶于100ml Hanks液，并加入20mmol/L Hepes）、Ⅳ型膠原酶灌注液（將50mgⅣ型膠原酶溶于100ml Hanks液，加入20mmol/L Hepes）、振蕩消化液（將15mg鏈霉蛋白酶E、15mgⅣ型膠原酶、1mg DNA酶Ⅰ溶于50ml Hanks液）。上述溶液經(jīng)過濾除菌，37℃預(yù)熱處理。終止消化液（含12ml DMEM培養(yǎng)液及3ml胎牛血清，4℃預(yù)冷處理）、離心稀釋液（含0.25%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基及20mmol/L Hepes）、HSC培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基及20mmol/L Hepes）。上述溶液中添加100μg中效鏈霉素和100 U/L青霉素。密度梯度離心液（利用高糖DMEM培養(yǎng)液，配制濃度分別為15.0%和11.5%的Optiprep密度梯度離心液）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟[6]（1）改良原位消化：大鼠經(jīng)7%水合氯醛麻醉后，十字切口剖腹，暴露肝臟腔靜脈、門靜脈主干及其分支，結(jié)扎門靜脈側(cè)支，于門靜脈近端剪口，置入一次性靜脈輸液管，緩慢推注前灌注液，同時(shí)結(jié)扎上下腔靜脈，待肝臟脹大至約2倍大小時(shí)，剪開上下腔靜脈。肝表面顏色變?yōu)辄S白色時(shí)，依次灌注鏈霉蛋白酶E灌注液、Ⅳ型膠原酶灌注液，待肝組織完全軟化成液體時(shí)停止消化。（2）振蕩消化及純化：Hanks液沖洗3次，修剪后剪碎肝臟組織，置于50ml離心管，37℃振蕩消化20min。隨后加入終止消化液、D-Hanks液，200目篩網(wǎng)過濾，離心取沉淀，D-Hanks液補(bǔ)液離心后分離上清液。（3）梯度離心：取沉淀，用15.0%Optiprep密度梯度離心液5ml重懸細(xì)胞，依次上覆11.5%Optiprep密度梯度離心液5ml和2ml D-Hanks液，4℃條件下以1 400r/min密度梯度離心20min，吸取11.5%Optiprep密度梯度離心液和D-Hanks液之間的細(xì)胞層，并用D-Hanks液、離心稀釋液沖洗。（4）細(xì)胞培養(yǎng)：重懸細(xì)胞，以1×106/ml密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后首次換液，此后每2d換一次液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底后，進(jìn)行傳代。HSC培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)液，然后加入不同處理因素共同培養(yǎng)48h，進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 HSC鑒定方法

1.5.1 臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HSC存活率 0.4%臺(tái)盼藍(lán)10μl加至90μl細(xì)胞懸液，混勻后滴至載玻片，靜置鏡下觀察，淡藍(lán)色為死細(xì)胞，未著色者為活細(xì)胞。HSC存活率=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5.2 α-SMA鑒定及HSC純度計(jì)算 倒置相差顯微鏡下觀察HSC形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)狀態(tài)變化。1次傳代后，于細(xì)胞爬片進(jìn)行α-SMA免疫組化鑒定，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。HSC純度=α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)× 100%。

1.63H-TdR和3H-Pro摻入法測(cè)定HSC增殖和膠原合成 各組大鼠HSC培養(yǎng)24h后取上清液，通過3H-TdR和3H-Pro摻入法，同步檢測(cè)96孔板中HSC的增殖和膠原的合成。濾膜冷卻后移入存有5 ml閃爍液的閃爍杯中，避光放置一段時(shí)間后，用FJ-2107液閃計(jì)數(shù)器測(cè)量放射性，結(jié)果用刺激指數(shù)（SI）表示。各組隨即加入3H-TdR或3H-Pro 1μCi/孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，自動(dòng)液閃計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。

1.7 Western blot檢測(cè)p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，上樣檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，膠片貼近曝光，顯影、定影后用Bio-Rad系統(tǒng)掃描分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HSC鑒定結(jié)果 培養(yǎng)24h后，臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)提示大鼠HSC存活率＞90%。倒置熒光顯微鏡下，多數(shù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈星形、多邊形、紡錘形，內(nèi)含大量脂滴，在熒光顯微鏡328nm波長(zhǎng)紫外光激發(fā)下，自發(fā)一過性熒光，見圖1。新分離的HSC α-SMA染色陰性，1次傳代后，多數(shù)細(xì)胞α-SMA染色陽(yáng)性，即HSC純度＞95%，見圖2。

圖1 HSC形態(tài)學(xué)觀察（×100）

圖2 α-SMA免疫組化鑒定（免疫組化二步法染色，×100）

2.2 各組 HSC增殖和膠原合成比較 AngⅡ組[（4 120±105）次/min]、Leptin組 [（3 740±110）次/min]、Leptin+AngⅡ組[（5 010±120）次/min]的3H-TdR合成明顯高于對(duì)照組[（2 450±100）次/min]，比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；與AngⅡ組和Leptin組比較，Leptin+ AngⅡ組的3H-TdR合成也明顯增高（均P＜0.05）。

同樣，AngⅡ[（2 730±60）次/min]、Leptin[（2 520±67）次/min]、Leptin+AngⅡ組[（3 450±75）次/min]的3H-Pro合成也明顯高于對(duì)照組[（1 340±50）次/min]，比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；與AngⅡ組和Leptin組比較，Leptin+AngⅡ組的3H-Pro合成也明顯增高（均P＜0.05）。結(jié)果表明與對(duì)照組相比，其余3組HSC增殖和膠原合成均明顯增加（均P＜0.05）；其中Leptin+AngⅡ組的HSC增殖和膠原合成明顯高于另外兩組（均P＜0.05）。

2.3 各組HSC中p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，AngⅡ組、Leptin組、Leptin+AngⅡ組的p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白水平表達(dá)均明顯升高（均P＜0.05）；與AngⅡ組、Leptin組相比，Leptin+AngⅡ組的p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白表達(dá)也均明顯升高（均P＜0.05），見表1及圖3。

表1 各組HSC中p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白表達(dá)情況

圖3 各組HSC中p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白電泳圖（1：對(duì)照組；2：AngⅡ組；3：Leptin組；4：Leptin+AngⅡ組）

3 討論

有報(bào)道稱，隨著HF的進(jìn)展，肝病和肝硬化患者瘦素水平逐漸升高，而且瘦素水平與HF程度成正比，表明其可能在HF發(fā)生中起一定的作用[7-8]。在活化人HSC細(xì)胞系和鼠HF模型分離出的HSC中，瘦素和Ⅰ型膠原蛋白mRNA含量增加[8]。故瘦素水平升高可以誘導(dǎo)HSC活化，增強(qiáng)肝內(nèi)纖維化因子活性，導(dǎo)致HF的發(fā)生、發(fā)展。HSC活化并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞是HF發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[9]。HSC位于肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞間，對(duì)肝臟微血管結(jié)構(gòu)和功能有著重要的調(diào)節(jié)作用。HSC活化后能夠促進(jìn)多種血管生成因子的分泌，促進(jìn)血竇內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而促進(jìn)血管新生，加速HF的進(jìn)程。

肝臟局部AngⅡ是導(dǎo)致HF的重要調(diào)節(jié)因素，AngⅡ能促進(jìn)HSC的激活、增殖，促使細(xì)胞外基質(zhì)大量積聚，在HF形成中起重要作用[10]。本研究中，其余3組的HSC增殖和膠原合成均明顯高于對(duì)照組；與AngⅡ組、Leptin組相比，Leptin+AngⅡ組HSC增殖和膠原合成明顯增多，說明瘦素能夠活化AngⅡ，促進(jìn)HSC增殖和膠原合成，誘導(dǎo)HF的發(fā)生、發(fā)展。曹琦等[11]研究表明肝臟局部AngⅡ能激活ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在HSC增殖、活化或其他功能改變過程中起到重要的作用。目前有研究證實(shí)瘦素和AngⅡ都能夠激活ERK1/2信號(hào)途徑，Zhou等[12]研究顯示在肝臟中瘦素能夠上調(diào)AngⅡ水平，而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）能夠降低肝臟組織中瘦素水平。Cao等[13]研究表明，JAK-STAT途徑是瘦素的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過激活JNK1、2，從而激活ERK1/2途徑，使HSC表達(dá)α（I）膠原增加，而應(yīng)用ERK1/2抑制劑能夠有效降低HSC中α（I）膠原表達(dá)水平，表明瘦素通過ERK1/2途徑促進(jìn)HSC膠原表達(dá)，從而導(dǎo)致HF。另外Saxena等[14]研究發(fā)現(xiàn)，瘦素可增加ERK磷酸化水平，應(yīng)用ERK抑制劑能夠阻斷促HSC增殖效應(yīng)，表明瘦素通過MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)HSC激活及膠原蛋白表達(dá)。本研究中，AngⅡ組、Leptin組、Leptin+AngⅡ組的p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比均明顯升高；而與AngⅡ組、Leptin組相比，Leptin+AngⅡ組的p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白水平也明顯升高，說明在HF過程中，瘦素可能通過上調(diào)AngⅡ表達(dá)，從而激活ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。但瘦素作用于ERK通路的上游靶點(diǎn)還不是很清楚，還需要進(jìn)一步研究瘦素誘導(dǎo)肝纖維化損傷的信號(hào)通路靶點(diǎn)，為臨床治療提供理論依據(jù)。

[1]Lemoine M,Ratziu V,Kim M,et al．Serum adipokine levels predictive of liver injury in non-alcoholic fatty liver disease[J]．Liver Int,2009,29(9):1431-1438．

[2]Wang J,Leclercq I,Brymora J M,et al．Kupffer cells mediate Leptin-induced liver fibrosis[J]．Gastroenterology,2009,137(15): 713-723．

[3]Tang Y,Zheng S,Chen A．Curcumin eliminates leptin's effects on hepatic stellate cell activation via interrupting leptin signaling[J]．Endocrinology,2009,150(19):3011-3020．

[4]Jiang J X,Mikami K,Shah V H,et al．Leptin induces phagocytosis of apoptotic bodies by hepatic stellate cells via a Rho guanosine triphosphatase-dependent mechanism[J]．Hepatology,2008,48 (5):1497-1505．

[5]Floreani A,Variola A,Niro G,et al．Plasma adiponectin levels in primary biliary cirrhosis:a novel perspective for link between hypercholesterolemia and protection against atherosclerosis[J]．Am J Gastroenterol,2008,103(8):1959-1965．

[6]丁芹,顧琳,馬會(huì)慧,等．SD大鼠肝臟星狀細(xì)胞分離培養(yǎng)及方法的改進(jìn)[J]．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2007,23(18):2830-2832．

[7]De Minicis S,Seki E,Oesterreicher C,et al．Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase mediates fibrotic and inflammatory effects of leptin on hepatic stellate cells [J]．Hepatology,2008,48(6):2016-2026．

[8]Elinav E,Ali M,Bruck R,et al．Competitive inhibition of leptin signaling results in amelioration of liver fibrosis through modulation of stellate cell function[J]．Hepatology,2009,49(1):278-286．

[9]Huang Y,Huang C,Li J．Effect of cytokines secreted from Kupffer cell on HSC proliferation,apoptosis in hepatic fibrosis process[J]．Chin Pharmacol Bull,2010,26(1):9-13．

[10]Saiki A,Ohira M,Endo K,et al．Circulating angiotensinⅡis associated with body fat accumulation and insulin resistance in obese subjects with type 2 diabetes mellitus[J]．Metabolism, 2009,58(5):708-713．

[11]曹琦,李俊．瘦素在肝臟疾病中的作用及分子機(jī)制[J]．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2004,20（9）:972-976．

[12]Zhou Y,Jia X,Wang G,et al．PI-3K/AKT and ERK signaling pathways mediate leptin-induced inhibition of PPARgamma gene expression in primary rat hepatic stellate cells[J]．Mol Cell Biochem,2009,325(1-2):131-139．

[13]Cao Q,Mak K M,Liber C S．Leptin enhances alpha1(I)collagen gene expression in LX-2 human hepatic stellate cells through JAK-mediated H2O2-dependent MAPK pathways[J]．J Cell Biochem,2006,97(7):188-197．

[14]Saxena N K,Titus M A,Ding X,et al．Leptin as a novel profibrogenic cytokine in hepatic stellate cells:mitogenesis and inhibition of apoptosis mediated by extracellular regulated kinase (ERK)and AKt phosphorylation[J]．FASEB J,2004,18(5):1612-1614．

Effect of leptin on hepatic stellate cells in liver fibrosis rats and its relation to ERK signal transduction pathway

ObjectiveTo investigate the effect of leptin on hepatic stellate cells(HSC)in liver fibrosis rats and its relation to ERK signal transduction pathway． Methods The purified HSCs were obtained by the modified in situ perfusion and Optiprep density gradient centrifugation．The survival rate of HSCs was evaluated by trypan blue exclusion test,the identification of HSCs was tested by α-SMA immunocytochemical staining,and the morphological changes were observed by light microscope．The cultured HSCs were divided into four groups:the control group,the angiotensin II group(Ang II,10-7mol/L),the Leptin group (Leptin,100ng/ml),and the Leptin+Ang II group[Leptin(100ng/ml)+AngⅡ(10-7mol/L)]．The HSCs proliferation and collagen synthesis were measured by3H-TdR and3H-Pro incorporation methods．The protein levels of p-ERK1/ERK1,p-ERK2/ERK2 and Ang II were detected by Western blot．Results The survival rate of rat HSCs was＞90%and the purity of HSCs was＞95%after passage 1．The findings of HSCs proliferation and collagen synthesis showed that compared with control group,the proliferation and collagen synthesis of HSCs were significantly increased in the Ang II,Leptin and Leptin+Ang II groups(P＜0．05);compared with the Ang II,Leptin groups,the HSCs proliferation and collagen synthesis were significantly increased in leptin+Ang II group (P＜0．05)．Western blot analysis showed that compared with the control group,the protein levels of p-ERK1/ERK1,p-ERK2/ERK2 and Ang II were significantly increased in Ang II,Leptin and Leptin+Ang II groups(P＜0．05);compared with Ang II,Leptin groups, the protein levels of p-ERK1/ERK1,p-ERK2/ERK2 and Ang II were significantly increased in Leptin+Ang II group(P＜0．05)．Conclusion Leptin may up-regulate the Ang II levels,activate the ERK signal transduction pathway,stimulate the HSCs proliferation and collagen synthesis,and then result in the liver fibrosis．

Leptin Hepatic fibrosis HSC ERK Signal transduction mechanism

2013-12-10）

（本文編輯：胥昀）

溫州市科技局基金項(xiàng)目（Y20090296）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染內(nèi)科