細梗香草總皂苷誘導肺癌細胞H460凋亡及其機制的研究

費正華 陳云亮 馬勝林

細梗香草總皂苷誘導肺癌細胞H460凋亡及其機制的研究

費正華 陳云亮 馬勝林

目的 觀察細梗香草總皂苷（LC）對非小細胞肺癌H460細胞增殖和凋亡的影響。方法 在H460肺癌細胞培養(yǎng)時加入不同濃度的LC，采用MTT法和克隆形成實驗檢測細胞的增殖活性，AnnexinⅤ/PI（FCM）法觀察LC對肺癌細胞凋亡的誘導作用和周期分布的影響。DCFH-DA熒光探針FCM檢測細胞內活性氧生成，Western blot法檢測NF-κB、I-κB、Bax、Bcl-2、Capase-3的蛋白表達。 結果 LC可抑制H460細胞生長，具有劑量、時間依賴性；LC作用H460細胞后克隆形成率明顯下降。LC可引起H460細胞凋亡，并可將H460生長阻滯在S期。LC以濃度依賴方式增高H460細胞內活性氧水平，還可使H460細胞I-κB、Bax和Capase-3表達增加，而使NF-κB和Bcl-2表達降低。結論 LC可以抑制H460細胞增殖，可能是通過增加細胞內活性氧表達，激活了肺癌細胞線粒體凋亡途徑。

細梗香草 肺癌 凋亡 活性氧

非小細胞肺癌惡性程度高，在腫瘤相關死亡原因中排首位[1]。許多患者初診時即為晚期，因此失去手術機會。以鉑類為基礎的第三代化療藥物在非選擇性的晚期非小細胞肺癌中總體有效率為30%～40%，帶來的生存獲益有限，且存在一定的毒副反應[2]。尋找新的高效低毒的藥物是肺癌治療重要的研究方向。祖國傳統(tǒng)中草藥在腫瘤治療中具有增效減毒的獨特優(yōu)勢，但對具體的藥效機制等基礎研究相對缺乏[3-4]。本文旨在研究細梗香草（Lysimachia capilliposide hemsl）提取物總皂苷（Capilliposide，LC）對非小細胞肺癌H460細胞的作用及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及細胞株 人肺癌細胞株H460由上海生物細胞庫提供。LC由浙江大學生物醫(yī)學工程學系實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶由美國GI月CO公司提供；新生小牛血清（FCS）由杭州四季青生物科技有限公司提供；MTT由美國Sigma公司提供；活性氧（ROS）檢測試劑盒和月CA定量試劑盒由南通碧云天生物科技有限公司提供；細胞凋亡和周期檢測試劑盒由杭州聯(lián)科生物公司提供，抗體NF-κ月、I-κ月，Capase-3由美國Santa Cruz公司提供，月ax、月cl-2及相應二抗由美國CST公司提供。

1.2 方法

1.2.1 生長抑制率檢測 將H460細胞以2.0×105/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃過夜。將細胞分觀察組和對照組。觀察組分別加入0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/ ml的LC。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。采取MTT法檢測，加入1mg/ml的MTT溶液100μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后棄上清液，加入150μl/孔酸化異丙醇，振蕩10min后用酶標儀檢測每孔D490值，計算H460細胞存活率。細胞存活率=觀察組D490/對照組D490×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.2.2 克隆形成實驗 取對數(shù)生長期H460細胞，消化接種于培養(yǎng)皿，每皿加入9ml含500個H460細胞的培養(yǎng)液。分3組加入0、2、4μg/ml LC，每組重復3次。培養(yǎng)箱培養(yǎng)14d，棄培養(yǎng)液后P月S洗滌細胞2次，4%多聚甲醛固定10min，P月S洗滌細胞3次，用結晶紫染色液染色10min，雙蒸水洗滌后，將計數(shù)＞50個細胞克隆并拍照。1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡率 取對數(shù)生長期的H460細胞,調整細胞的初濃度至（2.0×105）個/ ml加入6孔板,分3組加入0、2、4μg/ml LC。置37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,收集細胞,以70%乙醇固定24h后P月S液洗滌2次,離心（離心半徑30cm，500r/min，離心5min）后棄上清液。分別加入5μl AnnexinV-FITC和10μl碘化丙啶（PI），混勻。在室溫下，避光反應5～15min檢測細胞凋亡率。加入70%冷乙醇固定細胞，再加入10μl PI,混勻，檢測細胞周期分布，以上實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞內ROS水平 取對數(shù)生長期的H460細胞,調整細胞的初濃度至（2.0×105）個/ ml加入6孔板,分3組加入0、2、4μg/ml LC。置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h,收集細胞。加入 10μmol/L DCFH-DA孵育2～3 h，然后用無血清的1640培養(yǎng)基洗滌3次，流式細胞儀用EPICS-XL型流式細胞儀以488 nm為激發(fā)波長，525 nm為發(fā)射波長測定細胞內的熒光強度。

1.2.5 Western blot檢測凋亡相關蛋白 取對數(shù)生長期的H460細胞,調整細胞的初濃度至（2.0×105）個/ml加入6孔板，分3組加入0、2、4μg/ml LC。置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，收集細胞提取總蛋白，月CA法測定蛋白濃度，制備10%SDS-PAGE凝膠。每孔加入100μg樣品進行電泳，半干法轉膜，將蛋白轉至NC膜上，5%脫脂奶粉液封閉1 h，分別加入相應一抗（1∶1000稀釋），4℃孵育過夜，T月ST洗膜3次，選擇辣根過氧化物酶標志的二抗（1∶500稀釋）室溫孵育1 h，應用ECL化學發(fā)光顯色。月and Leader軟件進行條帶灰度半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示。兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 不同濃度LC對H460細胞增殖的影響 不同濃度LC分別作用H460細胞24、48、72h，其中1～32μg/ml濃度LC對H460細胞的增殖均有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性抑制。LC作用24h和48hH460細胞IC50分別為2.85μg/ml、2.08μg/ml（圖1）。根據(jù)IC50結果，選取2、4μg/ml濃度的LC進行作用機制方面的研究。

圖1 不同濃度LC對H460細胞生長抑制作用

2.2 克隆形成實驗 0、2、4μg/ml的LC作用于肺癌H460細胞24h后接種于培養(yǎng)皿，繼續(xù)克隆培養(yǎng)14d后，克隆形成數(shù)分別為（403.6±40.9）個、（292.3±26.4）個和（92.6±10.7）個。觀察組細胞集落形成能力明顯弱于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 LC作用H460細胞后克隆形成能力

2.3 LC對肺癌H460細胞周期和凋亡的影響 0、2、4μg/ml的LC作用于肺癌H460細胞24h后流式細胞儀檢測早期凋亡率分別為（2.2±0.3）%、（21.5±3.2）%和（19.8±2.9）%，晚期凋亡率分別為（1.3±0.1）%、（15.9± 2.6）%和（28.9±3.4）%，與對照組比較，LC的早晚期凋亡率差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖3。不同給藥濃度觀察組的H460細胞的S期細胞比例增多,G1/G0期和G2/M期細胞比例減少，早晚期凋亡率均增高。0、2、 4 μg/ml的LC作用于肺癌H460細胞24h后S期細胞的比例分別為（12.35±1.72）%、（34.75±4.15）%和（44.02± 5.02）%，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4。

2.4 LC對肺癌H460細胞ROS的影響 見圖5。

圖3 LC作用于H460細胞凋亡率的改變

圖4 LC作用于H460細胞S期細胞比例的改變

圖5 LC作用于H460細胞ROS的改變

由圖5可見，2、4 μg/ml的LC作用于肺癌H460細胞 3h后細胞內熒光強度分別為（15.81±2.1）%和（32.54±5.7）%。與對照組[（3.07±0.5）%]比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.5 LC對肺癌H460細胞對凋亡相關蛋白的影響 Western blot檢測0、2、4 μg/ml的LC作用于肺癌H460細胞24h后凋亡相關蛋白表達。2、4 μg/ml組與對照組比較，蛋白I-κ月、月ax和 Capase-3表達增加，而NF-κ月和月cl-2表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01），見圖6、表1。

表1 LC（0、2、4μg/ml）作用于肺癌H460細胞24h凋亡相關蛋白的相對表達量

圖6 LC作用H460細胞后凋亡相關蛋白的改變情況

3 討論

目前，尋找天然的抗腫瘤化合物依然是研制抗腫瘤新藥的一個重要策略。在既往抗腫瘤藥物研發(fā)過程中，超過60%為天然藥物或者是以天然產物為先導的合成和半合成衍生物[5]。細梗香草又名滿山香，為報春花科珍珠菜屬植物，主要分布于我國華南地區(qū)，民間多用于治療感冒咳嗽、風濕痹痛、月經不調及抗腫瘤等。田景奎教授等采用HPLC-ELSD法提取了LC，主要包括皂苷月和皂苷C兩種成分[6-7]。體內外研究發(fā)現(xiàn)LC對前列腺癌、胃癌、卵巢癌等具有較好抗腫瘤活性，但其在非小細胞肺癌中作用及具體機制尚無文獻報道[8-9]。本文通過LC作用肺癌H460細胞，研究其對肺癌增殖、凋亡的影響，并初步研究相關機制。

細胞凋亡是細胞在特定基因控制下的自主性死亡過程，體內腫瘤的發(fā)生是由于機體組織細胞增殖和凋亡的調控機制失調而引起的，細胞凋亡是機體維持平衡的關鍵環(huán)節(jié)。中藥及其提取物對肺癌細胞的抑制作用往往與誘導細胞凋亡有關[10-11]。在本實驗中MTT及克隆形成實驗均發(fā)現(xiàn)LC對肺癌細胞具有生長抑制作用，具有時間和劑量依賴性。進一步流式細胞儀檢測凋亡率發(fā)現(xiàn)，不同濃度LC作用肺癌細胞24h發(fā)現(xiàn)H460細胞凋亡比例明顯上升，早晚期凋亡均明顯。細胞周期是生命活動的基本過程，細胞內存在一系列監(jiān)控機制確保細胞周期各時相轉化有序進行，細胞凋亡和細胞周期的進程是密切相關的，當DNA受損或復制不完全時細胞周期將停留于某一時相，待DNA修復或復制完全后方可進入下一時相，若DNA不能修復或不能完全復制則啟動凋亡機制引起細胞凋亡。姜黃素可以引起LoVo結腸癌細胞凋亡，并使癌細胞阻滯在S期[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)LC作用肺癌細胞后S期細胞比例明顯上升，H460細胞大量在S期堆積，阻止了向G2/M期的轉變，減緩癌細胞有絲分裂過程，從而導致腫瘤細胞快速凋亡。

ROS是體內氧化代謝產物，在真核細胞有氧呼吸過程中形成的，是重要的信號分子[13]。腫瘤細胞通常含有較高水平的ROS，維持腫瘤生長的相關轉錄因子持續(xù)激活。但同時，腫瘤細胞內較高水平的ROS也使其在受到各種攻擊時，比正常細胞更易于死亡[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)LC作用肺癌細胞3h后ROS達峰值，低濃度組，高濃度組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義。ROS可以通過激活多種細胞因子來調控細胞生長周期，如YAP,NOX1等。在前面研究中我們也觀察到肺癌細胞被LC阻滯在S期，與其他文獻結果相似。研究發(fā)現(xiàn)ROS的激活能降低線粒體跨膜電勢，開放線粒體膜通透性轉變并釋放線粒體細胞色素C，并能通過抑制氧化半胱氨酸殘基降解來減少對I-κ月的激活，使NF-κ月通路轉錄受到抑制[15]。研究表明NF-κ月是調控多種基因的重要轉錄因子[16]，該通路能調節(jié)下游多種腫瘤增殖及凋亡相關蛋白，如月cl-2，月ax，月ad，CytoC蛋白等[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，2μg/ml和4μg/ml LC作用H460細胞后抑制了NF-κ月通路。與對照組比較，NF-κ月表達降低，I-κ月表達增加，差異均有統(tǒng)計學意義。同時，凋亡促進蛋白月ax和Capase-3酶表達明顯增加，凋亡抑制蛋白月cl-2表達降低。月cl-2家族被認為在線粒體凋亡通路中起關鍵作用[18]。月cl-2表達降低，而Cyto-C，月ax表達增加，可激活凋亡執(zhí)行蛋白，Capase-3酶。這些蛋白的激活或被抑制，最終激活啟動凋亡信號，導致腫瘤細胞出現(xiàn)DNA片段碎片，核固縮等典型凋亡特征。

LC通過促進H460細胞凋亡，抑制肺癌細胞的增殖，可能與LC使肺癌細胞被阻滯在S期，無法進行有絲分裂相關。另外，我們觀察到LC作用H460細胞后，肺癌細胞內ROS水平增高，抑制了NF-κ月通路，促進了下游促凋亡蛋白月ax的表達，抑制了月cl-2蛋白表達，啟動Capase-3酶來執(zhí)行凋亡命令，最終激活了線粒體凋亡途徑[18]。因此，LC有可能為非小細胞肺癌治療帶來新的方法。

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Capillipes inhibits proliferation and induces apoptosis of human lung cancer H460 cells

ObjectiveTo investigate the effect of capilliposides isolated from Lysimachia capillipes Hemsl(capillipes,LC) on proliferation and apoptosis of human non-small lung cancer cell line H460 in vitro．Methods H460 cells were cultured with different concentration of LC．The proliferation,colony formation and cell cycle of H460 cells were measured by MTT method, colony formation assay and flow cytometry,respectively．Intracellular reactive oxygen species(ROS)was measured by FCM with fluorescent probe of DCFH-DA．The expression of signal transduction proteins NF-κB,I-κB,Bax,Bcl-2 and capase-3 was detected by Western blotting．Results The proliferation of H460 cells was inhibited and the ability of colony-formation was reduced;the apoptosis rate of H460 cells was increased（P＜0．05）and the cell cycle was arrested at S phase（P＜0．05）after cultured with LC for 24h．LC significantly increased ROS level in H460 cells in a concentration-dependent manner．LC up-regulated I-κB and Bax expression，and activated capase-3 enzyme（P＜0．05）while the expression levels of NF-ΚB and Bcl-2 were down-regulated（P＜0．05）．Conclusion LC can inhibit the growth and induce apoptosis of H460 cells,which may be associated with ROS generation and activation of mitochondrial apoptotic pathway．

Capilliposide Lung cancerApoptosis ROS

2013-05-27）

（本文編輯：楊麗）

310006 浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州市第一人民醫(yī)院腫瘤科（費正華為浙江中醫(yī)藥大學在讀博士生）；溫州醫(yī)科大學第一臨床學院腫瘤科（陳云亮）

馬勝林，E-mail：mashenglin@medmail.com.cn