全血EBV DNA載量檢測在兒童EB病毒感染中的應用價值

胡榮盛 徐亞麗 俞曉春 薛靜俊

全血EBV DNA載量檢測在兒童EB病毒感染中的應用價值

胡榮盛 徐亞麗 俞曉春 薛靜俊

目的 評價全血EBV DNA載量檢測在兒童EB病毒（EBV）感染中的應用價值。 方法 將231例EBV活動感染兒童（原發(fā)感染174例，復發(fā)感染57例）、258例非活動EBV感染兒童(EBV既往感染)、45例無EBV感染健康兒童采用自動核酸提取實時熒光定量PCR法檢測全血EBV DNA載量，探討其與EBV感染的關系。結果 EBV活動性感染組全血EBV DNA陽性率81．8%，全血EBV DNA載量為（3．99±0．96）lg Copies/ml。EBV原發(fā)感染組與復發(fā)感染組的全血EBV DNA陽性率差異無統(tǒng)計學意義（χ2= 0．419，P=0．517），EBV DNA載量差異無統(tǒng)計學意義（t=1．236，P=0．221）。非活動EBV感染兒童組全血EBV DNA陽性率10．9%，全血EBV DNA載量為（2．89±0．20）lg Copies/ml。EBV活動性感染組與非活動性感染組的全血EBV DNA陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 251．600，P=0．0001），全血EBV DNA載量差異有統(tǒng)計學意義（t=3．389，P=0．001）。非EBV感染組全血EBV DNA陽性率0。EBV原發(fā)感染組中，全血EBV DNA陽性率（82．7%）高于EBV-CA IgM陽性率（75．8%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6．160，P=0．008），兩者結果一致性不佳（Kappa=0．687）。以全血EBV DNA載量檢測陽性作為診斷依據，敏感度75．9%，特異度91．2%，診斷符合率84．4%；在全血EBV DNA載量為3．00lgCopies/ml時，是判斷兒童EBV活動性感染的最佳臨界點，敏感度70．1%，特異度95．3%，診斷符合率83．4%。結論 全血EBV DNA載量是監(jiān)測EBV活動性感染的獨立指標，在兒童EBV感染診斷、療效觀察和愈后評估中的具有重要意義。

兒童 全血EBV DNA載量 EB病毒 活動性感染

E月病毒（E月V）感染是兒科比較常見的病毒感染性疾病，感染時可累及全身多個系統(tǒng)，引發(fā)多種疾病，出現(xiàn)典型的傳染性單核細胞增多癥體征及其他復雜的臨床表現(xiàn)（發(fā)熱、咽痛、淋巴結腫大、肝脾腫大、全身乏力、頭痛）或隱性感染[1-3]，早期不能明確診斷，給臨床治療帶來困難。血液中E月V DNA載量的監(jiān)測在E月V感染相關疾病的診斷中是必不可少的，筆者采用自動核酸提取實時熒光定量PCR法檢測全血E月V DNA載量，探討全血E月V DNA載量檢測在兒童E月V感染診斷、療效觀察和愈后評估中的應用價值，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2012-05—2013-10我院就診疑似E-月V感染兒童534例，其中男298例，女236例，男女比例1.27∶1.00，年齡6個月～14歲，中位年齡4歲。根據病史、臨床表現(xiàn)、實驗室E月V抗體譜檢測結果等，將患兒分為E月V活動性感染組（原發(fā)感染、復發(fā)感染）、E月V非活動感染組（既往感染）及非E月V感染組，診斷與分組參照美國CDC E月V感染診斷標準及相關文獻[4-6]。E月V活動性感染組231例，男女比例1.21∶1.00，年齡6個月～12歲，中位年齡3歲，其中原發(fā)感染174例，復發(fā)感染57例。E月V非活動感染組258例，男女比例1.29∶1.00，年齡2～14歲，中位年齡5歲。非E月V感染組45例，男女比例1.33∶1.00，年齡1～14歲，中位年齡6歲。3組性別、年齡的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 所有患兒均抽取靜脈血4ml，分為2份，1份EDTAK2抗凝，用于全血E月V DNA載量檢測，全血標本均4℃密封保存，1周內完成檢測；另1份分離血清，用于E月V抗體譜檢測。血清標本均-20℃密封保存，1周內完成檢測。

1.2.2 儀器與試劑 E月V DNA熒光定量PCR試劑、標準品、質控品均由廣州中山達安科技股份公司提供；自動核酸提取儀為陜西天龍科技有限公司產品，自動核酸提取試劑購自陜西天龍科技有限公司；熒光定量PCR儀為美國A月I公司的A月I-7000；間接免疫熒光法（IFA）E月V抗體譜試劑盒購自德國OUMENG公司，熒光顯微鏡為德國萊卡公司產品。

1.2.3 IFA檢測 檢測E月V-CA IgG、E月V-CA IgG親和力、E月V-CA IgM、E月V-EA IgG、E月NA IgG，操作過程及結果判斷嚴格遵守試劑說明書。E月V抗體譜檢測結果感染分期：（1）原發(fā)感染（急性期）：低親和力E月V-CA IgG抗體、E月V-CA IgM、E月V-EA IgG抗體可陽性，E月NA IgG抗體陰性。（2）既往感染：高親和力E月V-CA IgG抗體，E月V-CA IgM和E月V-EA IgG抗體陰性，E月NA IgG抗體陽性（如E月NA抗體丟失，也可為陰性）。（3）復發(fā)感染（急性期）：高親和力E月V-CA IgG抗體，E月V-CA IgM和 (或)E月V-EA IgG抗體陽性，E月NA IgG抗體陽性（如E月NA抗體丟失，也可為陰性）。（4）無E月V感染：E月V-CA IgG抗體、E月V-CA IgM、E月V-EA IgG、 E月NA IgG均為陰性。

1.2.4 E月V核酸提取與檢測 （1）自動核酸提取：按照自動核酸提取試劑盒說明書，取待測全血樣本、試劑盒內陽性對照、陰性對照200μl，加入預先分裝好自動核酸提取液的板孔中，按設定的提取程序，自動執(zhí)行核酸提取，最終得到50μl核酸洗脫液，供PCR擴增用。（2）反應體系配制：取N×40μl混合液與N×3μl酶（Taq+ UNG）混勻（N為反應管數(shù)），3 000r/min離心10s，在每個反應管中加入43μl上述PCR反應混合液。然后取標準品、樣本、陽性對照、陰性對照的提取上清液各2μl依次加入上述反應管中，密封反應管，置A月I7000熒光定量PCR儀上運行PCR程序。（3）PCR擴增參數(shù)：反應管在93℃保溫2min，先按93℃45s→55℃60s循環(huán)10次，再按93℃30s→55℃45s循環(huán)30次，熒光檢測在第2次循環(huán)55℃45s時完成。根據說明書的結果判斷標準進行結果分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。E月V DNA含量均經對數(shù)處理，以（logCopies/ml表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，全血E月V DNA與血清E月V-CA IgM陽性率比較采用配對資料χ2檢驗，一致性檢驗采用Kappa分析，Kappa＞0.75為一致性良好判斷依據。

2 結果

2.1 各組全血E月V DNA檢測結果的比較 E月V活動性感染組全血E月V DNA陽性率81.8%，其中原發(fā)感染組與復發(fā)感染組間的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.419，P= 0.517）。E月V活動性感染組全血E月V DNA載量為（3.99±0.96）lg Copies/ml，其中原發(fā)感染組與復發(fā)感染組間的差異無統(tǒng)計學意義（t=1.236，P=0.221）。E月V非活動感染組全血E月V DNA陽性率10.9%，全血E月V DNA載量為（2.89±0.20）lg Copies/ml。E月V活動性感染組與E月V非活動感染組全血E月V DNA陽性率的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=251.6，P=0.0001），全血E月V DNA載量差異有統(tǒng)計學意義（t=3.389，P=0.001）。非E月病毒感染組全血E月V DNA陽性率0（0/45），詳見表1。

2.2 全血E月V DNA檢測結果與血清E月V-CA IgM檢測結果比較 174例E月V原發(fā)感染組中，全血E月V DNA與E月V-CA IgM檢測結果的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.16，P=0.008），全血E月V DNA陽性率82.7%（144/ 174）高于E月V-CA IgM陽性率75.8%（132/174），兩者結果一致性不佳（Kappa=0.687），詳見表2。

2.3 全血E月V DNA在兒童E月V活動性感染中的診斷價值 在231例E月V活動性感染組和258例E月V非活動性感染組中，以全血E月V DNA載量檢測陽性作為診斷依據，敏感度81.8%，特異度89.5%，診斷符合率85.9%，陽性預測值87.5%，陰性預測值84.6%。以全血E月V DNA載量檢測數(shù)據作受試者操作特征（ROC）曲線分析，曲線下面積0.889（標準誤為0.028；95%可信區(qū)間0.834～0.945），在全血E月V DNA載量為3.00lgCopies/ ml時，是判斷兒童E月V活動性感染的最佳臨界點，其診斷的敏感度70.1%，特異度95.3%，診斷符合率83.4%，陽性預測值93.1%，陰性預測值78.1%，見圖1。

表1 各組全血EBV DNA檢測結果的比較

表2 EBV原發(fā)感染全血EBV DNA與血清EBV-CA IgM檢測結果比較（例）

圖1 EBV活動性感染全血EBV DNA載量的ROC曲線圖

3 討論

兒童E月V初次感染年齡以2～6歲以下低年齡段為主，由于兒童機體免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，初次感染后不能徹底清除E月V，導致復發(fā)感染和隱性感染病例增多，在機體免疫功能下降和某些因素觸發(fā)下，潛伏的E-月V可以被再次激活，引起病毒復制及臨床疾病。長期E月V活動性感染可導致免疫功能紊亂，發(fā)生與免疫系統(tǒng)功能紊亂相關的多種疾病如淋巴瘤、傳染性單核細胞增多癥及類風濕關節(jié)炎等[3，7]。兒童E月V感染臨床表現(xiàn)多樣，與其相關的疾病很多，易誤診，實驗室診斷十分重要。IFA E月V抗體譜檢測可以綜合判斷出E月V感染時期，為E月V感染診斷的首選指標。

已有研究表明，E月V活動性感染外周血中存在高水平的E月V核酸，而檢測健康E月V攜帶者則發(fā)現(xiàn)其血漿中檢測不到E月V核酸，只存在于外周血的淋巴細胞內存在極少量E月V[6-7]。E月V活動性感染外周血中E月V核酸含量明顯高于健康攜帶者，提示外周血中E月V核酸檢測對E月V感染狀態(tài)評估有意義，是區(qū)別活動性與非活動性感染重要依據。本研究顯示，E月V活動性感染組全血E月V DNA陽性率81.8%（189/231），全血E月V DNA載量為（3.99±0.96）lg Copies/ml。全血E月V DNA載量與兒童E月V活動性感染有關，而與E月V原發(fā)感染還是E月V復發(fā)感染無關。少數(shù)非活動E月V感染兒童全血中也可檢測到低水平的E月V DNA，可能與E月V的潛伏或隱性感染有關。

國內外文獻報道，兒童E月V原發(fā)感染的實驗室診斷，采用最多的是檢測特異性VCA-IgM抗體，并以在傳染性單核細胞增多癥中的應用為主，其陽性率高達90%～100%[8-9]。本研究采用的病例包括典型的傳染性單核細胞增多癥及缺乏典型臨床表現(xiàn)的E月V感染者，發(fā)現(xiàn)E月V原發(fā)感染E月V-CA IgM抗體陽性率僅為75.8%，這可能與部分嬰幼兒缺乏典型臨床表現(xiàn)（如發(fā)熱、咽峽炎、肝脾淋巴結大與皮疹等），容易被忽視對E月V抗體的檢測或檢測時間不當有關，并且由于嬰幼兒的免疫系統(tǒng)不完善,無法對E月V產生充分的免疫反應，特異性IgM抗體在體液中達到一定效價需10 d左右,感染后4～8周消失；因此，如果單獨檢測E月V-CA IgM抗體來診斷E月V感染，將造成漏診。本研究顯示，在E月V原發(fā)感染組中，全血E月V DNA陽性率（82.7%）高于E月VCA IgM陽性率（75.8%），兩者結果一致性不佳(Kappa= 0.687)，表明全血E月V DNA是E月V原發(fā)感染的獨立的監(jiān)測指標，敏感性優(yōu)于E月V-CA IgM。

國外研究表明，外周血單個核細胞（P月MCs）中的E月V DNA載量是監(jiān)測病毒活動和預測疾病風險的常用指標，但分離外周血單個核細胞（P月MCs）的手工操作繁瑣，定量結果不準確[10-11]。全血或血漿E月V DNA核酸提取比外周血單核細胞更容易執(zhí)行，促進了實時定量PCR檢測E月V DNA載量的標準化，并且全血與外周血單個核細胞E月V DNA載量在監(jiān)測E月V活動性感染的準確性方面性能相當。本研究顯示，以全血E月V DNA檢測陽性作為兒童E月V活動性感染診斷依據，診斷的敏感度81.8%，特異度89.5%，診斷符合率85.9%，陽性預測值87.5%，陰性預測值84.6%。以全血E月V DNA載量3.00lgCopies/ml作為判斷兒童E月V活動性感染的臨界點，其診斷的敏感度70.1%，特異度95.3%，診斷符合率83.4%，陽性預測值93.1%，陰性預測值78.1%，表明無論是定性還是定量，全血E月V DNA檢測對兒童E月V活動性感染都具有很高的診斷價值。

綜上所述，全血E月V DNA載量是監(jiān)測E月V活動的獨立指標。兒童E月V感染和轉歸與機體的免疫功能密切相關，全血E月V DNA檢測在兒童E月V感染診斷、療效觀察和愈后評估中的具有重要意義。

[1]王亞軍,王尚昆．519例小兒EB病毒感染臨床分析[J]．中國醫(yī)學工程, 2011,19(1)：128-130．

[2]鄧繼巋,鄭躍杰,袁雄偉,等．兒童非典型EB病毒感染的臨床回顧分析[J]．中國實用兒科雜志,2006,21(2)：123-125．

[3]汪洋,許紅梅．EB病毒的流行病學研究進展[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志, 2010,12(31)：1405-1407．

[4]Klutts JS,Ford B A,Perez NR,et al．Evidence-based approach for interpretation of Epstein-Barr virus serological patterns[J]．Clin．Microbiol,2009,47(10)：3204-3210．

[5]MartinsTB,Litwin CM,Hill HR．Evaluation of a multiplexfluorescent microsphere immunoassay for the determination of Epstein-Barr virusserologic status[J]．AmJClin Pathol,2008,129(1)：34-41．

[6] Siennicka J,Trzcińska A．Laboratory diagnosis of Epstein-Barr virusinfection[J]．MedDosw Mikrobiol,2007,59(3)：259-266．

[7]Margaret L．Gulley and Weihua Tang Laboratory Assays for Epstein-BarrVirus-Related Disease[J]．Mol Diagn,2008,10(4)：279-292．

[8]劉春艷,閆靜,劉亞誼,等．EB病毒相關性傳染性單核細胞增多癥的血清學診斷[J]．中華流行病學雜志,2007,28(9)：898-900．

[9]De Ory F,Guisasola M E,Sanz J C,et al．Evaluation of four commercialsystemsforthediagnosisof Epstein-Barrvirusprimary infections[J]．Clin VaccineImmunol,2011,18(3)：444-448．

[10]Fafi-Kremer S,Brengel-Pesce K,Barguès G,et al．Assessment of automated DNA extraction coupled with real-time PCR for measuring Epstein-Barr virus load in whole blood,peripheral mononuclearcellsandplasma[J]．ClinVirol,2004,30(2)：157-164．

[11]Reinhard B R,Jasmin W,Michael B,et al．Detection and quantitation of Epstein-Barr virus(EBV)DNA in EDTA whole blood samples using automated sample preparation and real time PCR[J]．ClinChemLabMed,2010,48(3)：413-418．

Detection of whole blood EBV DNA load in children with EB virus infection

ObjectiveTo evaluate the detection of whole blood Epstein-Barr virus(EBV)DNA load in childhood EBV infection．Methods Two hundred and thirty-one children with active EBV infection(174 cases with primary infection and 57 cases with recurrent infection),258 children with previous EBV infection and 45 healthy children were enrolled in the study．Whole blood EBV DNA load was detected with automatic nucleic acid extraction method and real-time PCR．The relationship between EBV DNA load and EBV infection was analyzed．Results The positive rate of whole blood EBV in children with active EBV infection was 81．8%and the EBV DNA load was 3．99±0．96lg copies/ml．There were no significant differences between primary infection and recurrent infection groups(χ2=0．419,P=0．517 and t=1．236,P=0．221,respectively)．The positive rate and whole blood EBV DNA load in children with inactive EBV infection were 10．9%and 2．89±0．20lg copies/ml respectively;there were significant differences between active and inactive patients(χ2=251．6,P=0．0001 and t=3．389,P=0．001,respectively)．The positive rate of whole blood EBV DNA in healthy children was 0%．The positive rate of whole blood EBV DNA in primary EBV infection group was 82．7%, which was higher than that of EBV-CA IgM positive rate(75．8%,P=0．008)with a poor consistency(Kappa=0．687)．The sensitivity,specificity and accuracy of positive blood EBV DNA for diagnosis of EBV infection were 81．8%,89．5%and 85．9%,respectively．Taking DNA load of 3．00lg copies/ml as cut-off value the sensitivity,specificity and accuracy for diagnosis of active EBV infection were 70．1%,95．3%and 83．4%,respectively．Conclusion Detection of whole blood EBV DNA load can be used for diagnosis and prognosis of EB virus infection in children．

Children Whole blood EBV DNA load EB virus Active infection

2013-10-28）

（本文編輯：嚴瑋雯）

315600 寧海縣第一醫(yī)院檢驗科

胡榮盛，E-mail：huroshn@163.com