ARID2在胰腺癌組織中表達的臨床研究

吳芳 余勝 芮韜 何琦文 錢曉宇 何徐軍 陶厚權 馬英玉 趙仲生葉再元

●論 著

ARID2在胰腺癌組織中表達的臨床研究

吳芳 余勝 芮韜 何琦文 錢曉宇 何徐軍 陶厚權 馬英玉 趙仲生葉再元

目的探討ARID2在胰腺癌與癌旁組織中的表達情況及其與胰腺癌臨床病理特征的關系。方法采用免疫組織化學SP法,檢測60例胰腺腺癌及其癌旁組織中ARID2的表達情況，并結合臨床病理資料進行統計分析。結果ARID2主要表達于細胞核。胰腺癌組織中ARID2陽性表達19例（31．7%），癌旁正常組織中ARID2陽性表達46例（76．7%），差異有統計學意義（P＜0．01）。胰腺癌組織中ARID2的表達與腫瘤分化程度、分期、淋巴轉移及遠處轉移明顯相關（均P＜0．05），但與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位無相關性（均P＞0．05）。結論ARID2在胰腺癌中低表達，且其表達程度與胰腺癌進展呈負相關，提示其可能在胰腺癌發生、發展中發揮抑癌作用，是胰腺癌預后的良好指標，可為臨床診治提供一定的參考依據。

胰腺癌 ARID2 預后

胰腺癌惡性程度高、進展快、預后差，占全球癌癥死亡原因的第四位，其5年生存率低于5%，且近50年來無明顯改善[1]。胰腺癌的起病較隱匿，確診的胰腺癌患者中僅約20%的腫瘤較局限可以行外科切除，近80%則因發生轉移等無法切除[2]。行手術切除并輔以化療的胰腺癌患者，術后平均存活12～22個月，其5年生存率為20%～25%[3]。近年來的研究表明，胰腺癌的發生、發展是一個復雜的多階段過程，與癌基因表達失常或抑癌基因失活有關，其中染色質重塑復合物的突變與腫瘤的發生密切相關[4]。AT-rich interactive domain 2（ARID2）是從P月AF（一種參與依賴配體的核受體轉錄激活的SWI/ SNF染色質重塑復合物）中被分離鑒定的[5]，作為抑癌基因參與多種腫瘤的發生、發展，如在肝癌、肺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中都發現了其失活突變。然而，ARID2與胰腺癌相關性的研究較少，在胰腺癌發生、發展中的作用尚不清楚。本研究通過免疫組織化學SP法檢測ARID2在胰腺癌與癌旁組織中的表達情況，旨在探討ARID2在胰腺癌組織中的表達及意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2006-01—2013-01在浙江省人民醫院接受手術并切除的胰腺癌組織及相應癌旁組織標本各60例，均經常規HE染色和免疫組織化學檢測明確診斷，術前未作化療、放療。胰腺癌患者中男28例，女32例，年齡35～88（62.82±11.76）歲；按美國癌癥聯合委員會（AJCC）胰腺癌TNM分期（2010版）：Ⅰ期7例，Ⅱ期25例，Ⅲ期2例，Ⅳ期26例；分化程度：高分化12例，中分化26例，低分化22例；有淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移29例；遠處轉移26例，無遠處轉移34例。

1.2 主要試劑 小鼠抗人ARID2單克隆抗體 [購于美國Santa Cruz公司，ARID2（E-3）：sc-166117]；即用型免疫組化超敏SP試劑盒（SP-9000）和二氨基聯苯胺（DA月）顯色劑（均購于北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 免疫組化染色 石蠟包埋組織連續切片，厚度為4μm，60℃烤片2h，常規二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，蒸餾水浸泡，高壓鍋抗原修復3min。室溫下冷卻30min，3%H2O2室溫下孵育10min，以消除內源性過氧化物酶活性，P月S漂洗3min×3次。滴加試劑A（藍色液體）室溫孵育15min，傾去，勿洗。滴加稀釋度為1：50的ARID2抗體（稀釋劑為P月S）；陽性對照為已知陽性的胰腺癌組織，以P月S代替一抗作陰性對照。4℃冰箱中過夜。第2天取出后P月S漂洗3min×3次，滴加試劑月（黃色液體），室溫孵育15min，P月S漂洗3min×3次。滴加試劑C（橙色液體）室溫孵育15min，P月S漂洗3min× 3次，DA月顯色3min左右，蒸餾水漂洗，蘇木素復染細胞核，中性樹膠封片。

1.4 結果判斷 由2位有經驗的病理科醫師采用雙盲法對染色情況進行判斷。ARID2主要在細胞核表達，根據染色強度與陽性細胞比例綜合計分，細胞的染色強度可分為0分（染色陰性）、1分（淡黃色顆粒）、2分（棕黃色顆粒）、3分（褐色顆粒）；陽性細胞比例評分方法：0分（陽性細胞比例≤5%）、1分（5%＜陽性細胞比例≤25%）、2分（25%＜陽性細胞比例≤50%）、3分（50%＜陽性細胞比例≤75%），4分（75%＜陽性細胞比例≤100%）。根據兩項乘積的分數分類，分數≤4記為ARID2表達陰性，分數＞4記為ARID2表達陽性。

1.5 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件，率的比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 ARID2在胰腺癌組織及癌旁正常組織中的表達情況 ARID2主要表達于細胞核。胰腺癌組織中ARID2陽性表達（圖1）19例（31.7%），癌旁正常組織中ARID2陽性表達（圖2）46例（76.7%），差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 ARID2在胰腺癌組織的表達情況（A：SP法，×200；B：SP法，×400）

圖2 ARID2在胰腺癌旁正常組織中的表達（A：SP法，× 200，B：SP法，×400）

2.2 胰腺癌組織中ARID2的表達水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關系見表1。

由表1可見，胰腺癌組織中ARID2的表達與腫瘤分化程度、分期、淋巴轉移及遠處轉移明顯相關（均P＜0.05），但與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位無相關性（均P＞0.05）。

3 討論

ARID2屬于ARID家族，是從一種參與依賴配體的核受體轉錄激活的SWI/SNF染色質重塑復合物P月AF中被分離鑒定出來的[5]。SWI/SNF復合物是一種進化保守的多亞單位的染色質重塑復合物，對染色質重塑起著決定性作用，能夠利用ATP水解產生的能量動員核小體，使染色質重構，從而調節靶基因的轉錄，控制多種生物學過程包括細胞增殖和生長抑制[6]。越來越多的研究證實了這種復合物在腫瘤發生中的作用，它的幾個亞單位具有內在的腫瘤抑制因子活性，或者是腫瘤抑制基因激活所必須的。

染色質重塑通過影響核小體結構，為其他蛋白提供和DNA的結合位點，是表觀遺傳修飾模式中的一種重要機制，染色質重塑復合物若發生突變，可導致染色質不能重塑，影響基因的正常表達，導致疾病發生。若突變引起抑癌基因或調節細胞周期的蛋白出現異常，則可能會導致腫瘤的發生和發展。Gui等[4]推測，染色質重塑異常可能是導致膀胱癌發生的一個重要原因，其在97例膀胱移行細胞癌患者中檢測到59%的患者含有染色體重塑相關基因，其中就包括ARID2基因。Fujimoto等[7]對肝癌的全基因組測序也發現，約50%的腫瘤中存在ARID2突變。Li等[8]對129例肝細胞肝癌患者外顯子組測序并對比，發現其中18.2%攜帶有丙型肝炎病毒的肝細胞肝癌患者的染色質重塑基因ARID2發生了失活性突變。推測其可能原因為，ARID2的鈍化突變可抑制干擾素-α誘導的Jak-STAT信號肽，進而促使慢性丙肝向HCV相關性肝細胞肝癌轉化。另外，在肺癌及黑色素瘤中也發現了ARID2的失活性突變[9-10]。以上說明，ARID2基因失活性突變與多種腫瘤的形成密切相關。在胰腺癌的發生、發展中，月iankin等[11]利用基因測序和拷貝數分析的方法發現了新的突變基因，其中就包括參與染色質重塑的ARID2，但ARID2所起的作用尚不清楚，尤其是其與臨床病理特征的關系尚未見報道。

表1 胰腺癌組織中ARID2的表達水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關系（例）

本研究結果顯示，ARID2在胰腺癌組織中的陽性表達率顯著低于癌旁組織；在胰腺癌組織中ARID2的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、部位等無明顯相關性，而與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴轉移與否明顯相關，這預示著ARID2的表達失活可能導致腫瘤惡化及轉移。分析其可能原因為ARID2發生突變，導致染色質不能重塑，引起抑癌基因或調節細胞周期的蛋白出現異常，從而導致腫瘤的發生和發展，但是其具體機制還有待于進一步研究。由此可見，ARID2的表達與胰腺癌的分化程度、臨床分期、淋巴結轉移呈負相關，可考慮將其作為評估胰腺癌轉移潛能及判斷預后的指標之一，也將為胰腺癌的基因靶向治療提供新的思路。

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Clinical study on expression of ARID2 in pancreatic carcinoma

ObjectiveTo examine the expression level of ARID2 in pancreatic cancer and analyze its relationship with clinicopathological features of pancreatic cancer．MethodsImmunohistochemistry was used to detect ARID2 expression in 60 pancreatic cancer tissue and tumor-adjacent tissue specimens．The correlation between ARID2 and clinicopathological features of pancreatic cancer was analyzed．ResultsThe positive rate of ARID2 expression was significantly lower in pancreatic cancer than in tumor-adjacent tissue(31．7%vs 76．6%,P＜0．05)．ARID2 expression was negatively correlated with tumor stage,differentiation,lymph node metastasis and distant metastasis(P＜0．05),but showed no significant correlation with sex,age,tumor size and location(P＞0．05)．ConclusionDown-regulation of ARID2 expression in pancreatic cancer may contribute to tumor metastasis and development．ARID2 might be a marker for favorable prognosis as a tumor suppressor,which may provide experimental basis for diagnosis and treatment of pancreatic cancer．

Pancreatic cancer ARID2 Prognosis

2013-09-04）

（本文編輯：歐陽卿）

國家自然科學基金資助（81071991、81372598）

310014 杭州，浙江省人民醫院胃腸外科（吳芳、余勝、芮韜、何琦文、錢曉宇、陶厚權、葉再元），病理科（趙仲生），浙江省胃腸病學重點實驗室（何徐軍、馬英玉）

葉再元，E-mail：zaiyuanye@163.com