信號傳導與轉錄激活因子3及細胞周期蛋白D1在口腔鱗癌中的表達及意義

洪珍珍 何欣 洪滔

信號傳導與轉錄激活因子3及細胞周期蛋白D1在口腔鱗癌中的表達及意義

洪珍珍 何欣 洪滔

目的 探討信號傳導與轉錄激活因子3（stat3）及細胞周期蛋白D1（cyclinD1）在口腔鱗癌組織中的表達及其與臨床預后的關系。方法采用逆轉錄聚合酶鏈反應法（RT-PCR）對35例口腔鱗癌患者的癌組織、相應正常組織中stat3、cyclinD1基因mRNA的表達進行檢測，并結合臨床資料進行分析。結果鱗癌組織中stat3及cyclinD1mRNA的表達水平均明顯高于相應正常組織的表達，差異有統計學意義（P＜0．05或0．01）。鱗癌組織中stat3mRNA的表達與cyclinD1mRNA的表達無明顯相關（P＞0．05）。stat3、cyclinD1 mRNA的表達與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移明顯相關（P＜0．05），而與性別、年齡、發生部位、腫瘤大小和病理分級之間無明顯相關（均P＞0．05）。結論檢測stat3、cyclinD1mRNA的表達可能有助于口腔鱗癌淋巴結轉移和腫瘤臨床分期的預測；口腔鱗癌發生、發展中stat3基因在mRNA水平上對cyclinD1的調控作用不明顯。

stat3 cyclinD1 口腔 鱗狀細胞癌 信使RNA

信號傳導與轉錄激活因子3（stat3）在各種腫瘤細胞和組織中激活，通過調控下游靶基因如細胞周期蛋白D1（cyclinD1）等的表達調節轉錄，進而影響細胞的增殖、分化和凋亡，參與腫瘤的發生與發展[1-2]。cyclinD1是細胞周期相關蛋白，是G1/S期過渡的重要調控因子，可影響細胞周期，導致細胞失控性生長[3]。stat3通過調節cyclinD1的轉錄導致細胞周期紊亂，進而使細胞發生癌變。本研究通過逆轉錄聚合酶鏈反應法（RT-PCR）對口腔鱗癌患者的癌組織及相應癌旁正常組織中stat3、cyclinD1基因mRNA的表達進行檢測，旨在探討stat3和cyclinD1在口腔鱗癌發生、發展中的作用和意義。

1 材料和方法

1.1 組織標本 選取2005-07—2012-12在我院就診并手術治療的口腔鱗癌患者35例，所有患者術前均未行放療。其中男20例，女15例，年齡39～82（57±13.4）歲；高分化鱗癌25例（I級），中、低分化鱗癌10例（Ⅰ～Ⅱ級4例、Ⅱ級2例、Ⅱ～Ⅲ級2例、Ⅲ級2例）。所有手術標本均經病理確診，且腫塊手術切緣處未見癌組織浸潤。取腫塊邊界外1cm處的正常黏膜上皮組織作為對照。

1.2 試劑和引物 RNA提取試劑盒（Trizol），逆轉錄試劑盒及TaqDNA聚合酶均購自上海晶美生物工程有限公司。Stat3、CyclinD1及磷酸丙糖脫氫酶（GAPDH）引物用primer3.0軟件設計，由上海博亞生物技術有限公司合成。Stat3引物序列上游為：5′-TCT CCT ACT TCT GCT ATC TTT GAG-3′，下游為：5′-ATG GGT CTC AGA GAA CAC ATC-3′，擴增片段為116bp；CyclinD1引物序列上游為：5′-CCA GTG ACA AAC CAT CCA GT -3′，下游為：5′-GGA TAT TCC CAA ACC ATT CC-3′，擴增片段為371bp；內參GAPDH引物序列上游為：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游為：5′-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3′，擴增片段長度為180bp。

1.3 stat3、cyclinD1 mRNA表達水平測定 癌組織及癌旁正常組織切取后立即投入液氮中，轉移至-86℃冰箱中保存備用。采用RNA提取試劑盒從冰凍標本提取總RNA。按逆轉錄試劑盒說明，吸取2μl RNA樣本在20μl反應體系中進行逆轉錄反應。PCR反應體系為25μl，stat3、cyclinD1和GAPDH在同一反應體系中擴增。Stat3擴增條件為：94℃變性50s，56℃退火50s及72℃延伸1min，共進行32個循環（第6個循環末暫停，加入GAPDH引物）。CyclinD1擴增條件為：94℃變性50s，55℃退火50s及72℃延伸1min，共進行30個循環（第5個循環末暫停，加入GAPDH引物）。取10μl擴增產物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外線燈下觀察攝片，掃描后在ImageMasterVDS凝膠成像分析系統下進行分析。每個樣本stat3、cyclinD1目的擴增片斷吸光度（A）值與相應的內參GAPDH擴增片段的A值之比為stat3、cyclinD1 mRNA表達水平的定量指標。

1.4 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件，所得數據均以表示，組間比較采用配對t檢驗，stat3和cyclinD1表達的相關性采用Pearson直線相關分析，stat3 mRNA表達與各臨床指標的相關關系采用多元線性回歸分析。

2 結果

2.1 鱗癌組織及相應正常組織中stat3、cyclinD1 mRNA的表達情況 鱗癌組織中stat3及cyclinD1mRNA表達的電泳圖見圖1-2。鱗癌組織中stat3及cyclinD1mRNA的表達水平分別為0.77±0.32、0.78±0.58，相應正常組織中stat3及cyclinD1mRNA的表達水平分別為0.56± 0.23、0.49±0.40，鱗癌組織中stat3及cyclinD1mRNA的表達水平均明顯高于相應正常組織的表達（P＜0.05或 0.01）。鱗癌組織中stat3mRNA的表達與cyclinD1mRNA的表達無明顯相關（P＞0.05）。

圖1 鱗癌組織中stat3表達的電泳圖

圖2 鱗癌組織中cyclinD1表達的電泳圖

2.2 stat3、cyclinD1 mRNA的表達與口腔鱗癌患者臨床特征的關系 見表1。

表1 stat3、cyclinD1 mRNA的表達

由表1可見，stat3、cyclinD1 mRNA的表達與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移明顯相關（P＜0.05），而與性別、年齡、發生部位、腫瘤大小和病理分級之間無明顯相關（均P＞0.05）。

3 討論

基因改變及細胞周期的調控異常是細胞癌變過程中密切相連、不可分割的兩個分子事件。細胞周期調控異常導致細胞的持續增殖，是腫瘤發生的生物學基礎。已有研究表明，cyclinD1表達增高是由于基因轉錄水平的缺陷，結構上激活的stat3能在轉錄水平上調cyclinD1的表達。stat3激活和cyclinD1蛋白水平之間的可能聯系已于頭頸鱗癌中得到闡明[2，4-5]。頭頸鱗癌TGF-α/EGFR自分泌途徑中stat3的畸變激活，可以通過cyclinD1過表達在某種程度上促進腫瘤的惡變。

Nagpal等[6]對口腔癌組織標本中激活的stat3蛋白（p-stat3）表達的研究發現，癌旁正常上皮組織表達p-stat3，p-stat3在T1、T2分期的腫瘤組織中高表達，而在T3、T4分期的腫瘤中表達逐漸減少，表明stat3在早期行使信號轉導和轉錄激活功能，隨著細胞向惡性轉化，其表達逐漸減少；RT-PCR示stat3 mRNA在T1、T2分期的腫瘤組織中高表達，T3分期減少，T4分期又增高。本研究結果顯示，stat3 mRNA在口腔鱗癌相應正常組織中有表達，與癌組織的表達之間的差異有統計學意義，這說明stat3 mRNA在口腔鱗癌形成早期即可部分行使信號轉導和轉錄激活功能，在腫瘤組織中這種功能更活躍。這與Napal等的研究結果一致。本研究還表明，口腔鱗癌組織stat3 mRNA表達與與性別、年齡、發生部位、腫瘤大小、病理分級等臨床指標無明顯相關，但與淋巴結轉移、腫瘤分期有明顯相關性，在T1～T4分期的腫瘤組織stat3 mRNA表達水平逐漸增高，推測stat3 mRNA的表達可能有助于口腔鱗癌淋巴結轉移和腫瘤臨床分期的預測。

cyclinD1是參與細胞周期性G1/S轉換的重要正性調節因子[3]，正常情況下它在G1期是恒定的，其過度表達使細胞周期G1/S轉換時間縮短，細胞分裂速度加快，促進細胞周期的進程和細胞過度增殖，導致細胞癌變。cyclinD1基因目前已被證實是與腫瘤有最直接關系的癌基因[3，7-8]，在食管癌、喉癌、乳腺癌等多種腫瘤均有cyclinD1的基因擴增和過度表達，且cyclinD1過表達與頭頸部腫瘤的局部復發、淋巴結轉移及臨床分期相關。本研究結果顯示，口腔鱗癌的相應正常組織和癌組織中cyclinD1 mRNA的表達差異有統計學意義，癌組織中的表達明顯高于相應正常組織，說明腫瘤生殖旺盛，與其生長失控的特點相吻合，而其相應正常組織處于相對正常的細胞增殖狀態。鱗癌發生、發展過程中cyclinD1過表達，加速了細胞周期轉換，而細胞的快速分裂，導致腫瘤形成。

本文結果還顯示，stat3 mRNA與cyclinD1 mRNA的表達無明顯相關，推測口腔鱗癌發生、發展中stat3基因在mRNA水平上對cyclinD1的調控作用不明顯。由于本研究從mRNA水平研究發現stat3對cyclinD1轉錄調節并未發生變化，而已有的研究證實癌變過程中發揮作用的是p-stat3，故口腔鱗癌中stat3激活提高轉錄水平和cyclinD1上調之間的關系尚有待進一步深入研究。

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[4]Masuda M,Suzui M,Yasumatu R,et al．Constitutive activation of signal transducers and activators of transcription 3 correlates with cyclin D1 overexpression and may provide a novel prognostic marker in head and neck squamous cell carcinoma[J]．Cancer Res,2002,62(12):3351-3355．

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（本文編輯：歐陽卿）

《浙江醫學》對醫學論文中有關實驗動物描述的要求

在醫學論文的描述中，凡涉及實驗動物者，在描述中應符合以下要求：（1）品種、品系描述清楚，（2）強調來源，（3）遺傳背景，（4）微生物學質量，（5）明確等級，（6）明確飼養環境和實驗環境，（7）明確性別，（8）有無質量合格證，（9）有對飼養的描述（如飼料型、營養水平、照明方式、溫度、溫度要求），（10）所有動物數量準確，（11）詳細描述動物的健康狀況，（12）對動物實驗的處理方式有單獨清楚的交代，（13）全部有對照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

Expression of stat3/cyclinD1 pathway in oral squamous cell carcinoma and its significance

Objective To determine the expression and clinical significance of stat3/cyclinD1 pathway in oral squamous cell carcinoma(OSCC)．MethodsTissue specimens of carcinoma and matched normal mucosa were taken from 35 patients with OSCC．The mRNA expression of stat3 and cyclinD1 in tissue specimens were determined by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)．ResultsThe mRNA expression of stat3 and cyclinD1 gene in OSCC were significantly higher than that in normal mucosa(P＜0．05)．The expression of stat3 and cyclinD1 mRNA in OSCC was correlated with lymph node metastasis and clinical stages of tumor(P＜0．05),while was not correlated with sex,age,tumor location,tumor size and pathological grade (P＞0．05)．There was no correlation between expression of stat3 and cyclinD1 mRNA in OSCC tissue specimens (P＞0．05)．ConclusionDetermination of stat3 and cyclinD1 gene expression may contribute to predict lymph node metastasis and clinical stage of oral squaremous cell carcinoma．The results indicate that stat3 gene may not involve in regulation of cyclinD1 expression in the development of OSCC．

stat3 cyclinD1 Mouth Squamous cell Carcinoma mRNA

2013-11-08）

310003 杭州市紅十字會醫院口腔科

洪滔，E-mail：htown@163.com