羅紅霉素經caveolin-1-p-ERK 1/2對離體哮喘大鼠氣道平滑肌細胞cyclinD1表達的影響

陳慧君 王瑞麗 戴元榮

羅紅霉素經caveolin-1-p-ERK 1/2對離體哮喘大鼠氣道平滑肌細胞cyclinD1表達的影響

陳慧君 王瑞麗 戴元榮

目的 探討羅紅霉素（RXM）經caveolin-1-p-ERK1/2對離體哮喘大鼠氣道平滑肌細胞（ASMCs）cyclinD1表達的影響。方法將30只SPF級雄性SD大鼠隨機均分為對照組和哮喘組，以卵白蛋白致敏和激發復制哮喘氣道重塑模型；采用Image-Pro Plus Version 6．0圖像分析軟件測定支氣管壁和支氣管平滑肌層厚度；透射電鏡觀察兩組大鼠ASMCs微囊表達情況；CCK-8檢測不同濃度RXM[A組（只含0．1%DMSO）、R10組（含RXM10μg/ml+0．1%DMSO）、R25組（含RXM 25μg/ml+0．1%DMSO）、R50組（含RXM50μg/ml+0．1%DMSO）、R100組（含RXM 100μg/ml+0．1%DMSO）]干預哮喘ASMCs后細胞的增殖情況，Western blot測定caveolin-1、p-ERK、cyclinD1的蛋白表達。結果哮喘組支氣管壁和支氣管平滑肌層明顯增厚，而微囊表達匱乏。哮喘組大鼠支氣管壁與平滑肌層厚度均高于對照組（均P＜0．01）。各RXM干預組ASMCs A值均低于A組，其中R100組明顯低于A組（P＜0．05）。R100組caveolin-1表達明顯高于A組及R10組，cyclinD1表達明顯低于A組及R10組，差異均有統計學意義（P＜0．05或0．01）；R25、R50、R100組P-ERK表達均明顯低于A組，差異均有統計學意義（P＜0．05或0．01）。哮喘ASMCs增殖活性與caveolin-1蛋白表達呈負相關（P＜0．05），與p-ERK及cyclinD1蛋白表達呈正相關（P＜0．05或0．01）；caveolin-1與p-ERK蛋白表達呈負相關（P＜0．01），與cyclinD1蛋白表達呈正相關（P＜0．01）；p-ERK與cyclinD1蛋白表達呈正相關（P＜0．01）。結論RXM可能通過上調caveolin-1表達、抑制ERK1/2活化，進而影響cyclinD1的表達，從而抑制哮喘大鼠ASMCs增殖。

哮喘 氣道平滑肌細胞 Caveolin-1 p-ERK1/2 cyclinD1 羅紅霉素

氣道重塑是哮喘的重要特征，其結構改變包括氣道上皮損傷、上皮下纖維化、氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）增殖、杯狀細胞增生肥大以及血管生成[1]，其中ASMCs增殖在氣道重塑中的作用受到廣泛關注[2]。微囊是存在于細胞膜上的內陷微結構，微囊蛋白（caveolins）為其標記蛋白。研究表明，caveolins可調節多種細胞的增殖，其表達缺失與細胞過度增殖有關[3]。而caveolins中的caveolin-1在ASMCs中表達豐富。ERK1/2信號通路激活后可作用于核轉錄因子，與細胞的增殖和分化密切相關，筆者的前期研究證實哮喘大鼠氣道平滑肌層ERK1/2活化增加[4]。細胞增殖最終需通過細胞周期完成有絲分裂過程，在整個細胞周期中，G1/S期是真核細胞有絲分裂過程中的“限制點”，決定細胞是否進入周期進行有絲分裂。近年來的研究表明，細胞周期素D1（cyclinD1）與此“限制點”密切相關。羅紅霉素（roxithromycin，RXM）是一種半合成的十四元環大環內脂類抗生素，可以抑制哮喘大鼠氣道重塑，但其機制并未完全闡明。本實驗擬建立大鼠慢性哮喘模型，體外培養ASMCs，探討RXM是否可經caveolin-1-p-ERK1/ 2對cyclinD1表達產生影響，從而抑制離體哮喘ASMCs的增殖。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物：SPF級健康雄性SD級大鼠30只，4～6周齡，體質量100～120g。隨機分為對照組及哮喘組，每組15只。主要試劑：卵白蛋白（OVA，美國Sigma公司），兔源性caveolin-1多克隆抗體（美國Abcam公司），小鼠源性P-ERK1/2單克隆抗體、兔源性總ERK1/ 2單克隆抗體、小鼠源性cyclinD1單克隆抗體（美國Cell Siganling公司），HRP標記山羊抗小鼠IgG、HRP標記山羊抗兔IgG（江蘇碧云天生物技術研究所），RXM粉劑（法國Usiphar公司）。

1.2 方法

1.2.1 哮喘大鼠氣道重塑模型制備 參照Palmans等[5]的方法制備哮喘大鼠氣道重塑模型。致敏階段：第1天和第8天腹腔注射含1mg OVA和100mg氫氧化鋁的混合液1ml；激發階段：第15天開始霧化吸入氯化鈉溶液8ml（0.9%氯化鈉溶液與OVA混合，OVA終濃度為1%）激發哮喘，30min/次，隔日1次，共8周。對照組致敏階段腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1ml，激發階段以0.9%氯化鈉溶液8ml霧化。

1.2.2 支氣管壁與支氣管平滑肌層厚度測定 采用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析軟件測量兩組大鼠支氣管基底膜周徑（Pbm）、支氣管管壁總面積（Wat）、支氣管平滑肌面積（Wam）。并用Pbm將測得的Wat、Wam標準化，以Wat/Pbm、Wam/Pbm分別代表支氣管壁和平滑肌層厚度。

1.2.3 ASMCs體外培養及鑒定 按照文獻[6]所報道的方法培養原代及傳代ASMCs。取第3代ASMCs進行平滑肌細胞鑒定。

1.2.4 ASMCs微囊表達變化觀察 兩組大鼠均取第3～6代ASMCs制作電鏡標本，采用透射電鏡觀察微囊的表達情況。

1.2.5 RXM對哮喘大鼠ASMCs增殖的影響 將哮喘大鼠的ASMCs單細胞懸液按2×105/ml的密度接種于96孔板，100μl/孔，隨機分為A組（只含0.1%DMSO）、R10組（含RXM10μg/ml+0.1%DMSO）、R25組（含RXM 25μg/ml+0.1%DMSO）、R50組（含RXM50μg/ml+0.1% DMSO）、R100組（含RXM 100μg/ml+0.1%DMSO），并設立空白組（只含培養基，不含細胞），每組設6個復孔。首先用不含血清的RPMI 1640饑餓24h，使細胞同步于G0期，然后用含不同濃度RXM的10%F月S RPMI1640培養基培養48h。培養結束后，每孔加入10μl的CCK-8試劑，混勻后置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養1～4h。酶聯免疫檢測儀450nm波長條件下測定各孔吸光度A值。取6個復孔的平均值作為該組的代表值，重復5次。依下列公式計算各組ASMCs增殖活性：細胞增殖活性（%）=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%。As代表實驗孔吸光度值（含培養基、CCK-8、ASMCs、不同濃度RXM）；Ac：代表對照孔吸光度值（含培養基、CCK-8、ASMCs）；Ab：代表空白孔吸光度值（含培養基、CCK-8）。

1.2.6 caveolin-1、p-ERK、cyclinD1的蛋白表達 采用Western blot測定。取第6代哮喘大鼠的ASMCs，按“1.2.5 RXM對哮喘大鼠ASMCs增殖的影響”中的分組方法干預哮喘ASMCs，提取蛋白，月CA試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳、轉膜，室溫下5%脫脂牛奶搖床封閉1h，分別加caveolin-1兔抗大鼠多克隆抗體（1∶1 000）、p-ERK小鼠抗大鼠單克隆抗體（1∶1 000）、cyclinD1小鼠抗大鼠單克隆抗體（1∶1 000），4℃過夜。次日洗膜后加5%脫脂牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶2 500）或羊抗小鼠二抗（1∶2 500），室溫下搖床孵育1h，洗膜后滴加ECL發光液，根據熒光強弱選擇適當的時間顯影、定影。Gel pro軟件分析caveolin-1、p-ERK、cyclinD1蛋白光密度（OD）值，并與內參OD值比較作為各目的蛋白相對含量。

1.3 統計學處理 采用SPSS15.0統計軟件，所得數據均以表示。正態分布資料的多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett′s T3檢驗；非正態分布資料的多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Nemenyi法檢驗；兩變量的相關分析用Pearson直線相關法。

2 結果

2.1 兩組大鼠肺組織病理學改變情況 對照組大鼠結構完整，支氣管及血管周圍未見明顯炎細胞浸潤，支氣管平滑肌層未見明顯增厚（圖1）。哮喘組大鼠支氣管平滑肌層明顯增厚，管腔狹窄，周圍大量炎癥細胞浸潤（圖2）。

圖1 對照組大鼠肺組織病理改變（HE染色，×200）

圖2 哮喘組大鼠肺組織病理改變（HE染色，×200）

2.2 兩組大鼠支氣管壁和平滑肌厚度比較 對照組大鼠支氣管壁與平滑肌層厚度分別為（46.83±21.09）、（23.16± 2.79）μm，哮喘組大鼠分別為（105.72±24.31）、（45.93±14.59）μm，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

2.3 ASMCs體外培養及鑒定結果 體外培養的ASMCs于倒置顯微鏡下觀察呈束狀或螺旋狀，可觀察到典型的“峰-谷”狀（平滑肌細胞生長的重要特征，圖3）。平滑肌細胞內特異的α-actin免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見平滑肌細胞內的肌絲結構，沿細胞的縱軸分布（平滑肌細胞特有的結構，圖4）。

2.4 兩組大鼠ASMCs微囊透射電鏡觀察情況 正常組大鼠ASMCs微囊含量豐富，結構完整，形態及大小多變（圖5）；哮喘組大鼠ASMCs微囊表達明顯匱乏，結構破壞嚴重（圖6）。

圖3 倒置顯微鏡下體外培養ASMCs（×100）

圖4 激光共聚焦顯微鏡下ASMCs內部紅色絲狀物（×400）

圖5 透射電鏡下正常組ASMCs微囊（×6 000）

圖6 透射電鏡下哮喘組ASMCs微囊（×6 000）

2.5 不同濃度RXM對哮喘大鼠ASMCs增殖的影響 細胞增殖越多越快，顏色越深，所測吸光度A值越大。A組、R10組、R25組、R50組及R100組ASMCs A值分別為 0.64±0.13、0.54±0.13、0.52±0.12、0.45±0.13、0.38± 0.12，增殖活性分別為100%、87.6%、84.2%、73.4%、60.4%，各RXM干預組ASMCs A值均低于A組，其中R100組明顯低于A組（P＜0.05）。

2.6 各組哮喘大鼠ASMC scaveolin-1、p-ERK、cyclinD1蛋白的表達 見表1及圖7-9。

表1 各組哮喘大鼠ASMC scaveolin-1、p-ERK、cyclinD1蛋白的表達

由表1可見，R100組caveolin-1表達明顯高于A組及R10組，cyclinD1表達明顯低于A組及R10組，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）；R25、R50、R100組P-ERK表達均明顯低于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）。

2.7 相關關系 哮喘ASMCs增殖活性與caveolin-1蛋白表達呈負相關（r=-0.881，P＜0.05），與p-ERK及cy-clinD1蛋白表達呈正相關（r=0.933、0.988，P＜0.05或0.01）；caveolin-1與p-ERK蛋白表達呈負相關（r=-0.811，P＜0.01），與cyclinD1蛋白表達呈負相關（r=-0.696，P＜0.01）；p-ERK與cyclinD1蛋白表達呈正相關（r=0.921，P＜0.01）。

圖7 caveolin-1的表達

圖8 P-ERK的表達

圖9 cyclinD1的表達

3 討論

RXM是一種半合成的十四元環大環內脂類抗生素，不但有抗菌活性，而且還有免疫調節、抗炎和抗氧化活性[7]。戴元榮等[8]的研究發現，RXM與吸入性糖皮質激素聯合應用，可提高哮喘的治療療效。吳立琴等[9]的研究發現，RXM可通過PI3K途徑抑制哮喘大鼠ASMCs增殖。本研究結果顯示，隨著RXM干預濃度增高，細胞增殖活性逐漸下降，表明RXM抑制哮喘ASMCs增殖的作用具有濃度依賴性，當RXM濃度達到100μg/ml時，細胞增殖所受抑制明顯高于A組。

Caveolae是一種內陷微結構，研究發現其與細胞增殖相關的受體和信號蛋白在該結構中明顯富集[10]，提示caveolae可能參與細胞增殖過程。Caveolin-1是一種分子量為22kDa的跨膜蛋白，其N端含有一個由20個氨基酸組成的鉸手架區域，可以連接并調控多種受體和信號蛋白[11]。Gosens等[12]的研究發現，在絲裂原缺乏的條件下，siRNA敲除caveolin-1仍可導致ASMCs增殖，而且還發現在處于增殖狀態的平滑肌細胞caveolin-1的含量只有靜止狀態下的一半，提示caveolin-1可能負性調控ASMCs的增殖。本研究結果顯示，正常組大鼠ASMCs caveolae表達豐富，大小及體積多變，而哮喘組大鼠ASMCs caveolae表達明顯匱乏而平滑肌層明顯增厚，提示哮喘組大鼠caveolae/caveolin-1缺乏與ASMCs過度增殖有關；此外還發現，RXM干預哮喘組大鼠ASMCs后，caveolin-1表達增加，且與細胞增殖活性呈負性相關，提示RXM可通過增加caveolin-1的表達而發揮其抑制ASMCs增殖的作用。

ERK1/2可將信號由細胞表面受體轉移至細胞核，激活細胞的轉錄因子，與細胞增殖和分化緊密相關。筆者的前期實驗研究發現，哮喘大鼠氣道平滑肌層ERK1/ 2的活化增加。另有研究發現，采用β-環糊精或siRNA敲除caveolin-1可導致ERK1/2活化。本研究發現，caveolin-1表達與哮喘ASMCs增殖活性呈負相關，ERK1/2的活化與哮喘ASMCs增殖活性呈正相關，caveolin-1與p-ERK1/2的表達存在負相關，而且RXM干預哮喘ASMCs后caveolin-1表達增加、ERK1/2活化減少，提示RXM可通過上調caveolin-1表達、抑制ERK1/2活化而抑制ASMCs的增殖。

G1/S是真核細胞有絲分裂過程中的“限制點”。研究表明，cyclinD1與哮喘ASMCs增殖密切相關[13]。張愛芝等[14]的研究還發現，ERK信號通路可能通過對cyclinD1表達的調控而影響哮喘ASMCs增殖。本研究發現，哮喘ASMCs增殖活性及p-ERK蛋白表達均與cyclinD1表達呈正相關，caveolin-1蛋白表達與cyclinD1表達呈負相關，而且RXM干預哮喘ASMCs后，隨著caveolin-1上調、ERK1/2活化被抑制，cyclinD1表達逐漸下降，提示RXM可能通過caveolin-1-p-ERK1/2抑制了cyclinD1的表達，使細胞周期阻滯于G1/S期，從而抑制哮喘ASMCs增殖，但其確切機制仍有待進一步研究。

[1]Durrani S R,Viswanathan R K,Busse W W．What effect does asthma treatment have on airway remodeling[J]?J Allergy Clin Immunol,2011,128(3):439-448．

[2]Zuyderduyn S,Sukkar M B,Fust A,et al．Treating asthma means treating airway smooth muscle cells[J]．Eur Respir J,2008,32(2): 265-274．

[3]Gosens R,Stelmack G L,Dueck G,et al．Role of caveolin-1 in p42/p44 MAP kinase activation and proliferation of human airway smooth muscle[J]．Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006,291 (3):L523-L534．

[4]王瑞麗,陳慧君,戴元榮．caveolin-1和p42/p44MAPK在哮喘大鼠氣道重塑中的作用及羅紅霉素對其表達的影響[J]．溫州醫學院學報, 2013,43(3):166-170．

[5]Palmans E,Kips J C,Pauwels R A．Prolonged allergen exposureinduces structural airway changes in sensitized rats[J]．Am J Respir Crit Care Med,2000,161(2 Pt 1):627-635．

[6]吳海亞,戴元榮,尹娟．改良組織貼塊法培養大鼠氣道平滑肌細胞[J]．溫州醫學院學報,2010,40(6):571-573

[7]Takahashi H,Suzuki Y,Miyauchi Y,et al．Roxithromycin decreases ultraviolet B irradiation-induced reactive oxygen intermediates production and apoptosis of keratinocytes[J]．J Dermatol Sci,2004,34(1):25-33．

[8] 戴元榮,蔣利多．大環內酯類抗生素聯用吸入類固醇治療哮喘的臨床研究[J]．中國藥物與臨床,2006,6(6):423-425．

[9] 吳立琴,戴元榮,夏曉東．磷脂酰肌醇3激酶途徑在哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖中的作用[J]．溫州醫學院學報,2009,39(3):234-237．

[10]Halayko A J,Stelmack G L．The association of caveolae,actin, and the dystrophin-glycoprotein complex:a role in smooth muscle phenotype and function[J]?Can J Physiol Pharmacol, 2005,83(10):877-891．

[11]Foster L J,De Hoog C L,Mann M．Unbiased quantitative proteomics of lipid rafts reveals high specificity for signaling factors[J]．Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:5813-5818．

[12]Gosens R,Gerald L,Stelmack,et al．Role of caveolin-1 in p42/ p44 MAP kinase activation and proliferation of human airway smooth muscle[J]．Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006, 291:L523-L534．

[13]Lifen Q,Yongjian X,Xiansheng L,et al．PKC promotes proliferation of airway smooth muscle cells by regulating cyclinD1 expression in asthmatic rats[J]．Acta Pharmacol SinJun,2008,29(6): 677-686．

[14] 張愛芝,張煥萍,藺鵬翔．ERK活化對哮喘大鼠氣道重塑及cyclinD1表達的影響[J]．中國比較醫學雜志,2010,20(3):26-29．

Effect of roxithromycin on cyclin D1 expression in airway smooth muscle cells of asthmatic rats and its mechanism

Objective To investigate the effect of roxithromycin(RXM)on cyclinD1 expression in cultured airway smooth muscle cells（ASMCs）of asthmatic rats and its mechanism．MethodsThirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group and asthmatic group．The chronic asthma was induced by the sensitization and provocation of ovalbumin in rats．The total bronchial wall thickness(Wat/Pbm)and the bronchial smooth muscle thickness(Wam/Pbm)were measured with image-pro plus 6．0；the changes of caveolae in AMSCs were observed by transmission electron microscope．The proliferation of cultured ASMCs induced by different concentrations of roxithromycin(group A:0．1%DMSO,group R10:RXM10μg/mL+0．1%DMSO,groupR25:RXM 25μg/ml+0．1%DMSO,group R50:RXM50μg/ml+0．1%DMSO,group R100:RXM 100μg/ml+0．1%DMSO)was tested by CCK-8．The protein expressions of caveolin-1,P-ERK,cyclinD1 of ASMCs were measured by Western blot．ResultsThe Wat/Pbm,Wam/Pbm of asthmatic group were significantly higher than those of control group(P＜0．01)．There were a few of caveolae in ASMCs of asthmatic rats．A value in all intervention groups was lower than that in group A,particularly in group R100 (P＜0．05)．The expression of caveolin-1 in group R100 was significantly higher and the expression of cyclinD1 was significantly lower than those in group A and group R10(P＜0．05 or P＜0．01);the expression of P-ERK in group R25,R50,R100 were significantly lower than those in group A(P＜0．05 or P＜0．01)．There were significantly negative correlation of cell activity rate of asthmatic rats with the expressions of caveolin-1 protein(P＜0．05)and positive correlation with the expressions of P-ERK or cyclinD1 protein(P＜0．05 or P＜0．01)．The expression of caveolin-1 protein was negatively correlated with P-ERK and cyclinD1(P＜0．01), and the expression of P-ERK protein was positively correlated with cyclinD1(P＜0．01)．ConclusionRoxithromycin inhibits cy-clinD1 expression and cell proliferation in ASMCs from asthmatic rats,which is associated with up-regulation of caveolin-1 expressions and down-regulation of p-ERK expressions．

Asthma Airway smooth muscle cells Caveolin-1 p-ERK Roxithromycin

2013-05-31）

（本文編輯：歐陽卿）

浙江省衛生廳科研基金資助項目（2009A144）

321000 金華市中心醫院呼吸內科（陳慧君）；溫州醫科大學附屬第二醫院呼吸內科（王瑞麗、戴元榮）

戴元榮，E-mail：daiyr@126.com