紫杉醇生物可降解支架對豬損傷后膽管α平滑肌動蛋白及轉化生長因子β1表達的影響

楊瑾 蔡秀軍

紫杉醇生物可降解支架對豬損傷后膽管α平滑肌動蛋白及轉化生長因子β1表達的影響

楊瑾 蔡秀軍

目的 觀察紫杉醇涂層生物可降解支架對豬損傷后膽總管愈合過程中的α平滑肌動蛋白（α-SMA）、轉化生長因子β1（TGF-β1）表達的影響。方法采用浸泡法制作紫杉醇涂層生物可降解膽道支架。構建豬肝外膽管損傷修復模型，將紫杉醇生物可降解支架及裸支架分別置入豬膽管中，每組15只（分別為實驗組及對照組）。分別于術后1、3、6個月各處死5只并取材，觀察吻合口愈合情況，行免疫組化測定吻合口α-SMA和TGF-β1的表達情況。結果自行研制造的全新紫杉醇生物完全可降解膽道支架獲得成功。實驗組術后1、3、6個月α-SMA及TGF-β1著色強度及面積評分較高的分布均較對照組低，其中術后3、6個月兩組的差異有統計學意義（P＜0．05）。實驗組術后6個月與術后1、3個月α-SMA著色強度及面積評分分布的差異均有統計學意義（P＜0．05），而對照組術后6個月僅與術后3個月的差異有統計學意義（P＜0．05）。實驗組術后3、6個月與術后1個月TGF-β1著色強度及面積評分分布的差異均有統計學意義（均P＜0．05），而對照組術后6個月僅與術后1個月的差異有統計學意義（P＜0．05）。結論紫杉醇涂層生物可降解支架能降低豬損傷后膽管α-SMA、TGF-β1的表達，可在一定程度上抑制膽管狹窄趨勢。

紫杉醇 藥物洗脫支架 膽道 α平滑肌動蛋白 轉化生長因子β1

目前，膽道狹窄的處理仍是膽道外科的一大難題，突出表現為術后膽道瘢痕性攣縮和管腔狹窄，其成因主要與膽管壁特殊的組織結構與生理特點有關。膽總管屬于纖維彈性管道，愈合過程中由于受到膽汁、細菌感染等反復刺激導致巨噬細胞大量聚集，持續合成轉化生長因子β1（TGF-β1）等生長因子而使黏膜下大量原有的纖維細胞轉化為功能活躍的成纖維細胞，導致膠原過度合成，管腔瘢痕形成。成纖維細胞在TGF-β1持續刺激下還可轉化為肌成纖維細胞（MF月）。從成纖維細胞到MF月需要有α平滑肌動蛋白（α-SMA）的表達，α-SMA的表達是MF月分化最顯著的標記。而MF月的大量增生被認為是導致膽管瘢痕性攣縮的重要原因。紫杉醇是一種從紅豆杉中分離得到的天然抗癌藥物，可以抑制膽管上皮細胞與成纖維細胞的增生與遷移。本研究通過將紫杉醇涂層多聚乳酸生物可降解支架應用于豬膽管損傷模型，動態觀察該支架對豬損傷后膽管的TGF-β1和α-SMA表達的影響，評估其對膽管損傷后瘢痕狹窄形成的防治作用，從而為臨床防治膽道狹窄探索新途徑。

1 材料和方法

1.1 紫杉醇涂層多聚乳酸生物可降解支架的制備 主體支架為聚左旋乳酸生物可降解支架，由浙江大學高分子材料系協助合成。涂層材料為共聚物P（LLA-co-CL），以單體L-丙交酯（L-LA）和ε-己內酯（ε-CL）為原料，開環聚合而成。紫杉醇涂層材料配方為100mg紫杉醇粉末+900mg P（LLA-co-CL）+40ml四氫呋喃（THF）。將P（LLA-co-CL）共聚物切割成細小顆粒狀，按上述比例與紫杉醇粉末溶于兩者的共同溶劑THF中。將已經滅菌處理的聚左旋乳酸膽道支架逐一浸泡于上述溶液中，頃刻拿出后經真空烘干箱于30℃、-0.1Mpa條件下烘干至衡重。對照組支架為無紫杉醇藥物的涂層支架，涂層材料配方為900mg P（LLA-co-CL）+40mlTHF，制作方法同上。

1.2 實驗動物及手術方式 健康巴馬小型豬30只（上海妙迪生物科技有限公司提供），體重12～15kg。隨機分為紫杉醇支架組（實驗組）和裸支架組（對照組），每組15只。采用氯胺酮、速眠新Ⅱ聯合麻醉。距十二指腸上緣2cm處游離出膽總管（上下游離范圍不超過1cm），沿橫向切開膽總管前壁制作膽管損傷模型，切開范圍不超過膽總管兩側縱軸，約為其周徑1/3～1/2。將已制備的紫杉醇可降解支架或裸支架置入膽總管內。以4-O Vicryl線作黏膜對黏膜外翻全程吻合，針距約0.5～0.6cm，邊距0.3～0.4cm。

1.3 標本采集及指標檢測 兩組分別于術后1、3、6個月各取5只小豬，從原切口進腹。觀察腹腔粘連情況及吻合口愈合情況。剪開吻合口觀察大體標本后，取吻合口及上下0.5cm左右膽管組織浸泡于10%甲醛溶液中固定，行SMA、TGF-β1免疫組化染色。兔抗豬α-SMA多克隆抗體購自Abcam，免疫組化染色試劑盒購自中杉金橋生物技術有限公司，嚴格按照試劑盒說明操作。兔抗豬TGF-β1多克隆抗體購自月iovision公司，二步法抗兔通用型免疫組化檢測試劑盒購自基因科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明操作。

1.4 結果判定 正常膽管α-SMA陽性僅表達于膽管、血管壁的少量平滑肌。以細胞質和/或細胞膜染成棕黃色為陽性，α-SMA陽性表達于MF月胞質、血管、膽管平滑肌、中性粒細胞和淋巴細胞等炎性細胞。正常膽管TGF-β1表達陰性。以細胞質和/或細胞膜染成棕黃色為陽性。TGF-β1陽性細胞表達于肉芽組織、F月、巨噬細胞、中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等炎細胞及血管內皮細胞、平滑肌細胞胞質和細胞膜。根據陽性細胞的著色強度評分：“-”為陰性細胞，評為0分；“+”為細胞膜和/或細胞質染成淡棕黃色，評為1分；“+++”為深棕色評為3分；“++”則介于“+”與“+++”之間，評為2分。陽性細胞面積評分：陽性細胞所占面積＜總細胞數的25%評為1分；25%～50%評為2分；＞50%評為3分。兩項分數相加，即為最終得分。

1.5 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件，組間比較采用非參數檢驗，獨立樣本采用Mann-Whitney U檢驗，配對樣本采用Wilcoxon符號秩和檢驗。

2 結果

本實驗成功制備紫杉醇生物完全可降解膽道支架，測得支架紫杉醇載荷量為（923±7.40）μg。

2.1 大體形態學觀察 所有手術均順利完成，麻醉滿意，無術中死亡發生。兩組動物術后均恢復順利，無死亡及明顯膽瘺、膽道梗阻發生。術后1個月兩組膽管略有水腫，吻合口支架均在位，吻合口愈合良好；術后3個月支架均完全降解，實驗組吻合口無明顯狹窄現象，對照組可見膽管壁增厚，吻合口狹窄，遠端膽管擴張；術后6個月實驗組膽管無明顯擴張狹窄現象，對照組膽管壁增厚，吻合口狹窄、遠端膽管擴張較為明顯。

2.2 兩組免疫組化染色情況 見圖1。

2.3 兩組α-SMA不同陽性程度分布的比較 見表1。

表1 兩組α-SMA不同陽性程度分布的比較（例）

由表1可見，實驗組術后1、3、6個月α-SMA著色強度及面積評分較高的分布均較對照組低，其中術后3、6個月兩組的差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組術后6個月與術后1、3個月α-SMA著色強度及面積評分分布的差異均有統計學意義（均P＜0.05），而對照組術后6個月僅與術后3個月的差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 兩組TGF-β1不同陽性程度分布的比較 見表2。

圖1 免疫組化染色（A：α-SMA陽性表達；B：血管平滑肌α-SMA自身陽性內對照表達；C：TGF-β1陽性表達；D：血管平滑肌TGF-β1自身陽性內對照表達；×400）

表2 兩組TGF-β1不同陽性程度分布的比較（例）

由表2可見，實驗組術后1、3、6個月TGF-β1著色強度及面積評分較高的分布均較對照組低，其中術后3、6個月兩組的差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組術后3、6個月與術后1個月TGF-β1著色強度及面積評分分布的差異均有統計學意義（P＜0.05），而對照組術后6個月僅與術后1個月的差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

目前，損傷后膽管纖維化狹窄的處理仍是臨床膽道外科的一大難題[1]。隨著膽道外科工作的不斷普及和腹腔鏡手術的逐步推廣，損傷后膽管狹窄的問題，變得更加突出。據統計，膽道術后繼發膽管狹窄的發生率高達70%～80%，更有甚者由此引發阻塞性黃疸、多臟器功能損害甚至死亡等嚴重并發癥。當前臨床上尚缺乏理想的干預手段來有效的防治術后膽道瘢痕狹窄，如何預防及治療膽管狹窄已成為當今外科界所面臨的棘手問題。

紫杉醇是從紅豆杉中分離得到的一種天然抗癌藥物，可以牢固結合于微管β亞單位并可抑制微管動力，激活或調節多種與凋亡相關的基因或蛋白，抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡。現作為一線藥物廣泛應用于多種腫瘤的臨床治療[2-3]。目前的研究表明，紫杉醇不僅能作用于多種腫瘤細胞，還能抑制血管平滑肌細胞，膽管上皮細胞與成纖維細胞的增生與遷移。這為其應用于腫瘤以外領域奠定了扎實的理論基礎。

近年來，關于紫杉醇防治血管狹窄及組織纖維化方面的研究與報道漸增。國內外多項研究報道了紫杉醇在治療冠狀動脈狹窄、硬皮病及預防青光眼術后瘢痕形成等方面的確切療效[4-6]。紫杉醇在抗膽管纖維化狹窄方面的研究尚屬起步階段。Park等[7]利用尼龍線留存鼠膽總管制成增殖性膽管炎模型，成功驗證了局部一次性給予紫杉醇藥物能在短期內有效防止鼠膽管狹窄形成的結論，但具體機制不明。Choi等[8]通過體外培養細胞實驗證實，紫杉醇能抑制由大腸桿菌脂多糖引起的肌成纖維細胞的過度增生及Ⅰ型膠原蛋白的合成，并認為與其特異性地阻斷TGF-β1信號通路有關。Liu等[9]的研究也證實，低劑量紫杉醇能夠顯著抑制TGF-β1/Smad活性從而有效緩解硬皮病小鼠的纖維化程度。

TGF-β1是目前已知的與瘢痕形成最為密切、最具代表性的細胞因子，在損傷、炎癥及纖維化之間起著一個連接的作用[10]。它能影響愈合過程的所有階段，提供正常愈合所必需的信號物質，當這些信號受抑制、阻斷或過度表達時則可引起愈合不良或形成瘢痕。動物實驗證實，在膽管術后3～6個月傷口愈合晚期，TGF-β1在術后狹窄膽道組織中為高表達。由此可見，設法減少膽汁刺激引起炎癥反應的量和程度，抑制TGF-β1過度表達及其活性，理論上將有助于預防和減輕術后膽道瘢痕增生和管腔狹窄。為此，筆者設計研發了紫杉醇涂層多聚乳酸支架，它是一種完全可降解支架，在體內可以徹底降解為水和二氧化碳，不會引起炎癥反應和生物毒性。支架在位時可支撐吻合口、對抗膽管瘢痕收縮應力，有利于吻合口成形，并在一定程度上起到隔絕膽汁的作用；同時，其作為藥物載體，在達到藥物緩釋效果后可完全降解，免除了拔管及相應并發癥的發生，也擺脫了以往金屬支架永久存留的不良反應。本文結果顯示，實驗組各時間點TGF-β1的表達均低于對照組，其中術后3、6個月兩組間的差異有統計學意義，證實支架持續釋放的紫杉醇藥物可抑制TGF-β1過度表達及其活性，從而達到減緩膽管纖維化狹窄的作用。

MF月在增生性瘢痕和纖維化疾病中持續存在被認為是導致膽管瘢痕性攣縮的主要原因。從成纖維細胞到MF月需要有α-SMA的表達，α-SMA的表達是MF月分化最顯著的標記，實際上也就成為MF月的重要標志[11]。研究α-SMA在傷口愈合過程中的表達，可以更精確地了解MF月的生活周期和作用。本文結果顯示，對照組α-SMA各期表達均強于實驗組，其中術后3、6個月兩組間的差異有統計學意義，提示紫杉醇可以抑制成纖維細胞向MF月。目前，紫杉醇調控α-SMA表達的機制仍不明確，可能與TGF-β1有關。α-SMA在TGF-β1作用下促進肌成纖維細胞的增殖[12]，紫杉醇通過阻斷TGF-β1信號系統引起相應的α-SMA的減少，從而進一步抑制MF月的數量與功能。同時，TGF-β1還可通過自分泌方式正反饋調節TGF-β1mRNA及蛋白的表達與分泌。上皮下的TGF-β1可刺激成纖維細胞轉化為MF月，從而促進其產生更多的TGF-β1與Ⅰ型膠原蛋白，正反饋機制可逐步放大TGF-β1的增殖效應，最終導致膽管壁纖維化增厚。因此，早期抑制TGF-β1的活性與數量，阻斷其正反饋回路，理論上可影響之后的纖維化進程。

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Effect of paclitaxel-eluting biodegradable stent on expression of α-SMA and TGF-β1 in swine bile duct after injury

Objective To investigate the effect of a biodegradable paclitaxel-eluting biliary polylactide stent on the expression of α-smooth muscle actin(α-SMA)and transforming growth factor-beta1(TGF-β1)in swine bile duct after injury．MethodsThe paclitaxel-eluting biodegradable biliary polylactide stents were prepared by immersion method．A porcine bile duct injury model was established．Paclitaxel-eluting biodegradable stent were surgically inserted in the bile duct of 15 swines in experimental group,while biodegradable stent without paclitaxel were placed in rest 15 swines of control group．Animals were sacrificed 1,3 or 6 months after operation．The wound healing of the common bile duct was observed．The expression of α-SMA and TGF-β1 was also detected with immunohistochemical method．ResultsThe scores of staining intensity and the proportion of positively stained cells of α-SMA and TGF-β1 in paclitaxel group 3 and 6 months after the operation were lower than those in control group(P＜0．05)．In paclitaxel group,the difference of the score of staining intensity and the proportion of positively stained cells of α-SMA and TGF-β1 between 6 months after operation and 1 or 3 months after operation was significant(P＜0．05), whereas in control group,the difference was significant only between 6 months and 3 months(P＜0．05)．ConclusionLocal delivery of paclitaxel via a biodegradable stent can decrease the expression of α-SMA and TGF-β1 in the healing process of injured swine bile duct,which may be potentially used to relieve the billiary stricture．

Paclitaxel Drug-eluting stents Billiary tractα-SMA TGF-β1

2013-05-31）

（本文編輯：歐陽卿）

310014 杭州，浙江省人民醫院胃腸外科（楊瑾）；浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院普外科（蔡秀軍）