正畸力作用下大鼠牙髓組織中熱休克蛋白70的表達及意義

蘇士文 趙紫婷 程哲

●臨床研究

正畸力作用下大鼠牙髓組織中熱休克蛋白70的表達及意義

蘇士文 趙紫婷 程哲

目的 檢測正畸力作用下大鼠牙髓組織中熱休克蛋白70（Hsp70）的表達和分布，探討其在正畸移動中的作用和機制。方法建立大鼠正畸牙移動模型，分別在受力1、15、30d處死，制備左側上頜第一磨牙及其周圍牙槽骨的石蠟標本，采用免疫組織化學法檢測大鼠正畸牙移動過程中牙髓組織中Hsp70的表達情況。結果正常對照組、正畸加力1d組、正畸加力15d組和正畸加力30d組牙髓組織中Hsp70表達量分別為4．02±0．03、28．13±0．23、10．02±0．08、5．23±0．42，正畸加力1d組大白鼠牙髓組織中Hsp70表達量顯著高于正常對照組（P＜0．01），正畸加力15d組和正畸加力30d組與正常對照組的差異無統計學意義（P＞0．05）。結論Hsp70參與了正畸牙移動，并且保護了牙髓組織。

熱休克蛋白70 免疫組化 正畸力

熱休克蛋白（Hsp）又稱應激蛋白，是普遍存在于生物體細胞中在熱休克狀態下啟動的一系列特殊基因編碼合成的蛋白質。其中Hsp70有兩種同源體：Hsc70和Hsp70，Hsc70在正常牙髓組織中即有表達稱為結構型，而Hsp70在應激狀態下才有表達又稱誘導型，也是口腔醫學中關于牙髓損傷修復極為重要的一種Hsp。正畸治療初期很多患者會出現疼痛不適癥狀，嚴重者影響進食和情緒，甚至會出現敏感的牙體冷熱反應及咬合痛等而終止治療。目前，關于正畸力對牙齒的影響也僅局限于對牙周組織的研究，正畸力對牙髓組織的影響罕有報道。本研究采用免疫組織化學方法觀察Hsp70在正畸力作用下不同時段其在牙髓組織中的動態表達及定位情況，旨在探討正畸力作用下Hsp70在牙髓抗損傷作用中的表達及意義。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物：48只6周齡SPF級（無特定病原體動物）健康雄性Wistar大白鼠，由溫州醫科大學動物試驗中心提供，體重（220±10）g，適應性飼養1周。試劑：鼠抗人Hsp70單克隆抗體，二步法免疫組化試劑盒（A瓶：Chem-Mate EnVision+/HRP，兔/小鼠；月瓶：DA月緩沖稀釋液；C瓶：DA月原液），均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 動物分組及造模 將48只大白鼠隨機分為正常對照組、正畸加力1d組、正畸加力15d組和正畸加力30d組。采用加力方法對實驗組大白鼠左側上頜第一磨牙施以0.49N近中向正畸力，建立正畸牙移動的模型。正常對照組左側上頜第一磨牙只安裝加力裝置而不施加力作用。觀察比較4組大白鼠受力后變化。所有動物分別在加力后各時點處死，取含左側上頜第一磨牙及其周圍牙槽骨的組織塊，放入10%甲醛溶液中4℃固定24h，脫鈣、脫水、石蠟包埋。

1.3 免疫組化染色 按試劑盒說明進行：常規脫蠟水化；胰酶法修復抗原；阻斷內源性過氧化物酶活性；滴加50～100μl一抗工作液于組織上，室溫孵育30min，用P月S沖洗切片，浸泡5min，重復3次。取出切片，擦干組織周圍的液體，平放于濕盒中；滴加50～100μl A液（ChemMateTMEnVision+/HRP）于組織上，室溫孵育30min；滴加預備好的顯色劑DA月工作液50～100μl，室溫孵育5～10min，或光鏡下控制顯色；顯色完全后，用蒸餾水沖洗終止顯色；需要時，蘇木精復染；脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。

1.4 Hsp70表達判定及定量分析 Hsp70在細胞核及細胞質內均可表達，出現棕黃色即判定為陽性。免疫組化結果根據陽性細胞的百分率和陽性細胞數進行半定量處理。陽性細胞百分率＜5%為陰性，6%～30%為弱陽性，31%～60%為陽性，≥60%為強陽性，以陽性和強陽性為過表達。應用MIAS-300全自動分析儀，將免疫組化染色的切片在光鏡下統一放大200倍，每張切片上隨機選取5個視野進行細胞著色的統計學分析，計算機自動測量陽性細胞Hsp70的表達含量。

1.5 統計學處理 采用PASW statisticsl8統計軟件，所得計量資料均采用表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果 正常對照組牙髓組織中個別牙髓細胞質弱陽性染色，其余未見陽性表達（圖1）。正畸加力1d，牙髓成牙本質細胞及其相鄰成纖維細胞為陽性表達，部分細胞核著色，可見血管內皮細胞弱陽性表達（圖2）。正畸加力15d，牙髓組織中個別牙髓細胞質弱陽性染色，可見血管內皮細胞弱陽性表達（圖3）。正畸加力30d，牙髓組織中個別牙髓細胞質弱陽性染色，其余未見陽性表達（圖4）。

圖1 正常組牙髓組織（免疫組化染色，×200，下同）

圖2 正畸力1d牙髓組織

圖3 正畸力15d牙髓組織

圖4 正畸力30d牙髓組織

2.2 各組大白鼠牙髓組織中Hsp70表達量的比較 正常對照組、正畸加力1d組、正畸加力15d組和正畸加力30d組牙髓組織中Hsp70表達量分別為4.02±0.03、28.13±0.23、10.02±0.08、5.23±0.42，正畸加力1d組大白鼠牙髓組織中Hsp70表達量顯著高于正常對照組（P＜0.01），正畸加力15d組和正畸加力30d組與正常對照組的差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

Hsps作為一種非特異性的細胞內源性保護蛋白，Hsp70是其中最主要的一種，其重要的功能是參與耐受的形成。當細胞或組織受到應激時，Hsp70生成顯著增加，避免機體再次應激時遭受更為嚴重的損傷[1]。90年代初Sens等即已經發現Hsp在牙髓中表達，之后呂平等[2]報道了Hsp70在齲病中的表達，而趙紫婷等[3-4]也報道了Hsp在大鼠及人急慢性牙髓炎中的表達。另外，筆者的前期研究也發現人牙髓在正畸力作用下Hsp的表達[5]。

Hsp70作為分子伴侶的主要功能是清除細胞內積聚的異常蛋白，當牙體組織受到外界有害因素的不斷刺激后，成牙本質細胞即會受到不同程度的損害，使細胞內蛋白的合成受到影響，導致大量異常折疊的蛋白在細胞內積聚[6]。這些異常的蛋白可能即是引起熱休克反應的發起點，促使牙齒硬組織在受到程度不同的正畸力后，使牙髓組織合成更多的Hsp70與積聚的異常蛋白相互作用將其清除。

本研究結果顯示，在大鼠磨牙受正畸力1d后，牙髓組織中出現Hsp70的陽性表達，與正常組比較差異有統計學意義，在正畸力加力1d后Hsp70表達量達高峰，此時可以看到中性粒細胞呈陽性表達。在大鼠磨牙受正畸力15d后，牙髓組織中出現Hsp70的弱陽性表達，可能是細胞受到正畸力后期，大量的異常蛋白引起機體內Hsp70合成的大量增加。隨著正畸力的逐漸減退，細胞內異常蛋白的積累減少，牙髓細胞感受到這種變化，逐漸減少Hsp70的表達水平。此后，隨著牙髓組織內異常蛋白的清除，Hsp70的表達逐漸減少。至正畸加力30d后，胞核和胞質內Hsp70陽性表達水平趨于一致。這與李曉魯等[7]報道的Hsp70被誘導的數量與其保護作用的強弱呈正相關相符。

綜上所述，筆者認為Hsp70可能對反復刺激組織的存活具有重要意義，有目的的提高組織細胞Hsp70的表達水平將可以有效防止機體再次受到更強刺激時細胞功能受到損傷。在口腔正畸力下，應用輕力原則，間隔加力時間最好在1個月以上，可以有效避免牙周、牙髓組織的損傷。

[1]田鳳契,鄭金平,孫建婭,等．焦化作業工人淋巴細胞Hsp70表達及作用[J]．中國公共衛生,2007,23(2):204-205．

[2]呂平,邊專,陳智．熱休克蛋白70在人正常牙和齲壞牙牙髓中的免疫定位[J]．牙體牙髓牙周病學雜志,1999,9(4):267-269．

[3] 趙紫婷,王建平,蘇士文,等．大鼠磨牙牙髓組織在不同的機械刺激后Hsp70的表達及意義的研究[J]．口腔醫學,2010,30(6):339-342．

[4]趙紫婷,張紀綱,李瑩．熱休克蛋白70在人炎型牙髓組織中的表達及意義[J]．浙江醫學,2010,32(6):940-942．

[5]蘇士文．LF托槽在活髓牙排齊過程中對牙髓組織的影響[J]．口腔醫學, 2010,30(10):602-604．

[6]Terada K,Mori M．Mitochondrial protein import in animals[J]．Biochim Biophys Acta,1998,14(1):12-17．

[7]李曉魯,彭毅志,袁志強,等．熱休克蛋白70基因重組腺病毒載體微膠囊化及口服轉染的研究[J]．中華燒傷雜志,2003,19(3):145-147．

Expression of HSP70 in rat molars pulp tissue applied with orthodontic force

Objective To investigate the expression of heat shock protein 70 (Hsp70)in rat molars pulp applied with orthodontic force．MethodsThe animal model for tooth movement was established,and the rats were sacrificed in batches on d1, 15 and 30．The maxillary molars and periodontium specimens were obtained and the expression of Hsp70 was detected by immunohistochemistry．ResultsThe expression of Hsp 70 in control group and d1,d15,d30 orthodontic force groups were 4．02± 0．03 and 28．13±0．23,10．02±0．08,5．23±0．42,respectively．There was significant difference in Hsp 70 expression between control group and D1 orthodontic force group(P＜0．01),while there were no significant differences between control group and D15,D30 groups(P＞0．05)．ConclusionDuring the orthodontic tooth movement,HSP70 might be one of main cytokines in process of reparative dentin mineralization．

Hsp70 Immunohistochemistry Orthodontic force

2013-07-10）

（本文編輯：歐陽卿）

麗水市科技局課題（20110414）

323000 麗水市人民醫院口腔科（蘇士文、程哲）；麗水市中心醫院口腔科（趙紫婷）