重組人源甲胎蛋白在畢赤酵母中的高效表達及純化＊

嚴子琴，劉麗，劉俊，施思，李海龍，蔣哲，孟凡國，周海夢，徐蓓，丁先鋒，胡衛江，歐文斌△（.浙江清華長三角研究院／浙江省應用酶學重點實驗室／生物分析技術實驗室，浙江嘉興 4006；.中國計量科學研究院，北京 000；.浙江理工大學生命科學學院，浙江杭州 008）

人源甲胎蛋白（AFP）是一種腫瘤相關的單鏈糖蛋白，其糖鏈部分具有癌胚性變化的特征。AFP為胎兒時期肝臟合成的一種胚胎蛋白，出生1周后表達消失，以后完全被清蛋白所替代［1－3］。健康人不表達AFP，當患肝細胞癌、卵黃囊和胚胎樣腫瘤及部分肝外腫瘤時機體可重新合成AFP，因此臨床上AFP被當成一種肝癌及生殖細胞腫瘤的經典血清標志物來使用，且對良惡性腫瘤的診斷、腫瘤治療的療效監測及腫瘤預后都具有重要臨床意義［4－5］。本文從真核（畢赤酵母GS115）蛋白表達體系入手，研究人源AFP的重組克隆、異源高效表達、蛋白純化及臨床活性分析，為研制AFP標準物質及其可溯源校準品、質控品和體外診斷試劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種和培養基質粒pReceiver－AFP 由復能基因合成。質粒pPICZαA 購自Invitrogen。DH5α、BL21（DE3）和GS115均為本實驗室保存。LB培養基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，pH 7.0，固體培養基加2%瓊脂。BMGY 培養基：1mol／L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）10%，10×酵母無氨基氮源（YNB）10%，10×甘油10%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，500×生物素0.02%。BMMY 培養基：1mol／L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）10%，10×YNB 10%，10×甲醇10%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，500×生物素0.02%。

1.2 肝癌血清標本選擇3例臨床肝癌患者血清標本，標為1、2、3號。1號標本為女患者的血清，年齡50歲，AFP 為281661.00ng／mL，治療期給予的抗病毒藥物為阿德福韋酯；2號標本為男患者的血清，年齡28歲，AFP 為80200.45ng／mL，治療期間未給予抗病毒藥物治療；……