分子診斷在檢驗科的發展與未來＊

歐紅玲，原杰綜述，陳鳳華，王欣茹審校（解放軍第二炮兵總醫院：.檢驗科；.感染性疾病科，北京 00088）

隨著人類基因圖譜繪制的完成和生物醫學的發展，分子診斷技術成為21世紀最有潛力的學科之一。分子診斷是將分子生物學原理和技術應用于疾病診斷而產生的一門新興的檢驗醫學技術，是以疾病相關基因及其產物為檢測對象，從分子水平來探討疾病發生和發展的機制，從而為疾病的預防、診斷、療效評估、預后判斷等提供關鍵信息和決策依據。是當代醫學發展的重要前沿領域之一，其核心是基因診斷技術。

1 分子診斷的進展

分子診斷技術的開展基于人類對DNA、RNA 和蛋白質不斷深入的認識，1953年，Watson和Crick發現了DNA 雙螺旋結構，為人類揭開了生命本質神秘的面紗，為分子診斷的產生奠定了基礎。1963年，桑格發明了雙脫氧測序方法，為人類認識基因DNA 提供了方向。1972～1973年伯格等創建了重組DNA 技術，拓展了分子診斷技術。1976年，Kan等應用DNA分子雜交技術對α地中海貧血進行產前診斷，實現了疾病的早期診斷，標志著分子診斷技術開始應用于臨床檢驗中。1985年，聚合酶鏈反應（PCR）技術問世，極大地推動了分子生物學的發展，成為生物醫學領域中的一項革命性創舉和技術發展的里程碑。PCR 及其衍生技術因其操作簡便、快捷、適用性強，成為當今分子診斷領域中廣泛應用的技術方法。以生物芯片技術為代表的高通量密集型技術，因其支持物上有大量的探針，可以進行大量的檢測和分析，彌補了傳統核酸雜交存在的自動化程度低、檢測目的分子少、低通量等缺點，具有樣品處理能力強、用途廣泛、自動化程度高等特點，成為分子生物學技術領域的一大熱點，極大地促進了分子診斷學的發展。1990年開始啟動人類基因組計劃，到2003年，基因組計劃初步完成后，使分子生物學研究進入了功能基因組學研究，科學家們開始探索疾病和藥物耐藥性等與靶基因的相互關系，使醫學模式轉向個體化治療臨床研究階段。目前，分子診斷在實驗診斷市場中占的份額還不大，但增長得十分迅速，估計未來10年內，分子診斷技術將在實驗診斷中起主導作用。

2 分子診斷目前在檢驗科的應用

分子診斷是通過檢測核酸的結構異?；虻鞍椎谋磉_異常，對疾病或潛在疾病作出試驗診斷，分子診斷的技術方法決定了試驗診斷的應用。分子診斷的內容從單一診斷遺傳性疾病發展到一個全新階段，廣泛應用于感染性疾病、遺傳性疾病和腫瘤診斷等多個領域。當前分子診斷學在臨床應用主要有下面幾個方面。

2.1 在感染性疾病診療中的應用近年來不斷突發一些傳染性極強的新病原體，如非典型性呼吸綜合征（SARS）、H1N1甲型流感、H7N9禽流感，嚴重影響了公眾的健康和社會的安定。傳統的細菌培養、病毒分離等病原學檢測技術普遍存在耗時長、靈敏度差等不足，有些病原體還有臨床分離和培養難度大等特點，大大降低了檢測效率，難以在臨床抗感染治療中發揮有效的指導作用。隨著各種病原體基因結構的闡明，利用分子診斷技術能早期、快速、敏感、特異地檢測感染性病原體的DNA 或RNA。目前，與醫學相關的幾乎所有病原微生物均建立了PCR 檢測方法［1－2］，可通過特異引物擴增來檢測病原微生物的目標基因或者是通過通用引物擴增檢測細菌的16S rRNA 和真菌28SrRNA 基因序列，整個檢測過程耗時2～4 h，與傳統的細菌培養方法相比，敏感度和特異度大大提高，所以廣泛應用于各個領域。現在PCR 又發展到多重PCR、巢式PCR、反轉錄PCR 以及實時定量PCR 等。2000年日本學者Notomi等［3］公開了一種新的基因診斷技術，即環介導等溫擴增反應（LAMP），受到了世界衛生組織（WHO）和各國學者的關注，短短幾年，該技術已廣泛應用于臨床檢驗和醫學研究中，成功地應用于SARS、禽流感、HIV 等疾病的檢測中［4－6］，在甲型H1N1流感事件中，日本榮研化學公司接受WHO 的邀請進行H1N1環介導等溫擴增（LAMP）試劑盒的研制。通過榮研公司近十年的推廣，LAMP 技術已廣泛應用于日本國內各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測、食品化妝品安全檢查及進出口快速診斷中，并得到了歐美國家的認同。LAMP 方法的優勢除了高特異性、高靈敏度外，操作十分簡單，對儀器設備要求低，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現反應，結果的檢測僅通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成即可判斷，簡便快捷，適合基層快速診斷。使對病原微生物的分子診斷方法得到很大的改進。分子診斷不僅可以快速對病原體進行診斷和鑒別診斷，還可進行病原分型，以及病毒載量檢測，從而為個體化治療提高依據。

另外，細菌等病原微生物的耐藥性問題也成為臨床醫生面臨的一個難題，即達不到預期療效，也存在醫療資源的浪費，容易激化醫患矛盾。細菌的耐藥基因檢測可有助于醫生有針對性地選擇和使用抗菌藥物，設計新型抗菌藥物，對臨床正確用藥和新藥開發具有指導意義。各種病原菌耐藥基因檢測是當前耐藥機制研究的熱點，通過設計引物、PCR 擴增目標基因片段、對擴增產物進行分析或測序比對，獲得檢測結果，對耐藥菌株的早期檢出能夠及時準確使用抗菌藥物減少耐藥株的產生，同時控制耐藥性的傳播。張苑怡等［7］使用LAMP 技術以NDM－1基因為靶基因檢測多重耐藥菌中產β－內酰胺酶。Hanaki等［8］通過LAMP 技術檢測MecA 和femB 及qacA／B基因來鑒定耐消毒劑的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），能在1h內做出敏感性和特異性較高的結果。

2.2 遺傳性疾病目前已知的遺傳病有數千種，盡管一些遺傳病的發病率很低，但是一旦患病，患者的生活質量將大大降低，甚至無法生存，給家庭和社會帶來沉重的負擔。隨著人類基因組計劃的逐步完成，人類已掌握了幾乎所有已發現的遺傳病基因，通過遺傳病分子診斷從基因方面進行篩查，可以避免遺傳病患兒的出生，或者是盡早采取措施，提高患者的生活質量，減輕患者及家庭的經濟和精神負擔。所以臨床分子診斷對遺傳性疾病的診斷和產前篩查具有重要的意義。通過對血清或血漿進行PCR 檢測法布瑞氏癥，使用微滴PCR 檢測遺傳性耳聾、使用改良的反轉聚合酶鏈式反應（I－PCR）檢測血友病A、通過PCR 聯合低密度基因芯片技術的導流雜交可簡便、快速地從孕婦血漿中檢測20種常見胎兒地中海貧血等［9－12］。

2.3 腫瘤經過長期、大量的研究，科學家對腫瘤的認知逐漸鎖定到相應的基因方面，人類基因組序列和高通量分子分析技術的發展，使分子診斷技術在腫瘤的診治方面得到快速發展，人們能夠從DNA、RNA 和蛋白質水平上對腫瘤進行全面研究，從個體基因組中分析和鑒別患者之間存在的疾病相關個體差異，利用這些差異來合理指導臨床治療，推動了腫瘤的個體化治療方向［13］。38歲的好萊塢紅星安吉麗娜·朱莉通過基因檢測發現其乳腺癌易感基因BRCA1缺陷，切除雙乳以預防乳腺癌和卵巢癌的發生［14］。提示基因檢測在腫瘤的診斷領域將有很大的發展。對于腫瘤的個體化治療比較有代表意義的是對非小細胞肺癌（NSCLC）的靶向性治療，約20%的NSCLC患者是由于表皮生長因子受體（EGFR）的突變導致的［15］，EGFR是一種酪氨酸激酶，常見的突變發生于EGFR 的外顯子18～21上［16］。外顯子18、19、21、20（S769I）參與酪氨酸激酶結構域的編碼，突變導致EGFR 活性增加，磷酸化水平明顯升高，下游的增殖通路被激活，導致腫瘤的發生和惡化。因此，針對此類因基因突變引起的NSCLC，使用EGFR 酪氨酸激酶受體抑制劑（EGFT－TKIs）可有效抑制腫瘤。而如果是外顯子20（T790M）發生突變，則對EGFT－TKIs具有耐藥性，因此美國食品與藥品監督管理局要求在使用藥物EGFR－TKIs之前要先進行基因檢測，確定分子分型。并且對18～21外顯子的突變可通過血漿對來自腫瘤的微量DNA 進行檢測，為臨床上不能手術，同時不愿穿刺的患者提供了一種創傷小的替代檢測方案。

3 展望

分子診斷學將成為2l世紀檢驗醫學的主題。分子診斷技術將朝著高效、便捷、靈敏和無創傷性的方向發展；21世紀分子診斷學的技術優勢和巨大潛力，尤其是生物芯片的發展，將成為最有希望為改善世界各國人們的健康狀況做出貢獻的生物技術之一。隨著人類基因組計劃的完成和蛋白質組計劃的啟動，分子診斷方法將極大地推動現代檢驗醫學的發展，通過一滴血、一滴尿以及其他體液或組織，就可以簡單、方便地檢測幾乎所有的病原微生物、一些遺傳病基因和腫瘤標記物、還可以同步建成是否存在耐藥基因及耐藥位點的突變，并可以在更深層次揭示疾病的本質，指導臨床診治。

［1］Riahi R，Mach KE，Mohan R，et al.Molecular detection of bacterial pathogens using microparticle enhanced doublestranded DNA probes［J］.Anal Chem，2011，83（16）：6349－6354.

［2］Schuller M，Sloots TP，James GS，et al.PCR for clinical microbiology：An Australian and International Perspective［M］.Heidelberg：Springer，2010：14－33.

［3］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop－mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.

［4］Yang K，Sun K，Srinivasan KN，et al.Immune responses to T－cell epitopes of SARS CoV－N protein are enhanced by N immunization with a chimera of lysosome－associated membrane protein［J］.Gene Ther，2009，16（11）：1353－1362.

［5］Zhang J，Feng Y，Hu D，et al.Rapid and sensitive detection of H7N9avian influenza virus by use of reverse transcription－loop－mediated isothermal amplification［J］.J Clin Microbiol，2013，51（11）：3760－3764.

［6］Krawczyk P，Nico? M，Powrózek T，et al.Sensitive methods for the detection of an insertion in exon 20of the HER2gene in the Metastasis of non－small cell lung cancer to the central nervous system［J］.Oncol Lett，2013，6（4）：1063－1067.

［7］張苑怡，武娜，朱寶利，等.快速檢測NDM－1基因的環介導恒溫擴增技術的建立與評價［J］.生物工程學報，2011，27（8）：1232－1238.

［8］Hanaki K，Sekiguchi J，Shimada K，et al.Loop－mediated isothermal amplification assays for identification of antiseptic－and methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］.J Microbiol Methods，2011，84（2）：251－254.

［9］Nakano S，Morizane Y，Makisaka N，et al.Development of a highly sensitive immuno－PCR assay for the measurement ofα－galactosidase A protein levels in serum and plasma［J］.PLoS One，2013，8（11）：78588.

［10］Schrauwen I，Sommen M，Corneveaux JJ，et al.A sensitive and specific diagnostic test for hearing loss using a microdroplet PCR－based approach and next Generation sequencing［J］.Am J Med Genet A，2013，161（1）：145－152.

［11］He ZH，Chen SF，Chen J，et al.A modified I－PCR to detect the factor VIII Inv22for genetic diagnosis and prenatal diagnosis in haemophilia A［J］.Haemophilia，2012，18（3）：452－456.

［12］Yamada T，Azuma K，Muta E，et al.EGFR T790M mutation as a possible target for immunotherapy；identification of HLA－A＊0201－restricted T cell epitopes derived from the EGFR T790M mutation［J］.PLoS One，2013，8（11）：e78389.

［13］Sui X，Chen R，Wang Z，et al.Autophagy and chemotherapy resistance：apromising therapeutic target for cancer treatment［J］.Cell Death Dis，2013，4（16）：838.

［14］Nisker J.A public health education initiative for women with a family history of breast／ovarian cancer：why did it take Angelina Jolie［J］.J Obstet Gynaecol Can，2013，35（8）：689－694.

［15］Reguart N，Cardona AF，Carrasco E，et al.BRCA1：a new genomic marker for non－small－cell lung cancer［J］.Clin Lung Cancer，2008，9（6）：331－339.

［16］Liu Y，Wu BQ，Zhong HH，et al.Screening for EGFR and KRAS mutations in non－small cell lung carcinomas using DNA extraction by hydrothermal pressure coupled with PCR－based direct sequencing［J］.Int J Clin Exp Pathol，2013，6（9）：1880－1889.