不同時段社交應激對小鼠肺癌生長的影響

吳 曉 劉寶君 吳金峰 厲 蓓 弓唯一 徐海林 段曉虹 董競成

(復旦大學附屬華山醫院中西醫結合科 上海 200032)

不同時段社交應激對小鼠肺癌生長的影響

吳 曉 劉寶君 吳金峰 厲 蓓 弓唯一 徐海林 段曉虹 董競成△

(復旦大學附屬華山醫院中西醫結合科 上海 200032)

目的觀察不同時段社交應激對小鼠肺癌生長的影響。方法將36只C57BL/6J小鼠隨機分為A組(正常對照組)、B組(單純抑郁組)、C組(瘤前應激組)、D組(單純腫瘤組)、E組(瘤后應激組)、F組(5天應激組),每組6只。在10天社交應激模型的基礎上,C、D、E組分別在應激前、應激5天和10天后給予皮下種瘤。ELISA方法檢測各組小鼠血清中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表達, Western blot方法檢測肺組織中磷酸化細胞外信號調節激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases,p ERK)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白的表達,real-time PCR方法檢測血管內皮生長因子受體2(VEGFR2) m RNA%和L1細胞黏附分子(L1 cell adhesion molecule,L1CAM)等參數。結果C組和F組與其他各組比較,皮下腫瘤結節的重量、體積及與腫瘤生長有關的上述細胞因子的表達均明顯升高(P＜0.05)。E組與D組比較,兩者在腫瘤結節的重量、體積及相關細胞因子的表達上差異不大(P＞0.05)。結論發生在腫瘤發生之前及發生過程中的社交應激對小鼠肺癌有顯著的促生長作用,其內在機制有待進一步研究。

社交應激； 腫瘤生長； 社會心理因素； 細胞因子

在所有腫瘤疾病中,肺癌發病率居首位［1］,屬于全球范圍內的高發性疾病。抑郁、焦慮等社會心理因素被認為會影響疾病的發生和發展［2］。多項研究證實,社會心理因素不僅與腫瘤疾病的發生有關,而且還參與到腫瘤發展的各個階段［3］。同時,在腫瘤患者中也存在較高的抑郁癥發病率,其癥狀的發展被證明與腫瘤患者的預后息息相關［4］。腫瘤患者在經受腫瘤帶來的痛苦的同時,往往還要承受隨之發生的心理變化和影響,尤其是一些負面的社會心理因素,對疾病發展和轉歸都有不利影響［5］,甚至有患者在疾病康復后仍然受到社會心理因素的負面影響［6］。雖然社會心理因素對腫瘤生長的影響早已為科研及醫務工作者所重視和研究［7-12］,但是其在腫瘤發展不同階段的干預和影響鮮見報道。

本文通過模擬人類在社交應激壓力作用下的心理應激狀態,多次給予實驗小鼠社交失敗應激刺激,通過觀察和分析與人類相似的抑郁樣癥狀,建立模擬人類抑郁狀態的社交應激性抑郁動物模型。通過在腫瘤發展的不同階段給予社交應激干預,將小鼠腫瘤模型與社交應激性抑郁模型相結合,觀察與腫瘤發生和發展相關的若干指標,探討社會應激在腫瘤發展的不同階段對腫瘤生長的影響,從而為腫瘤伴發心理性疾病的治療提供一定的理論基礎。

材料和方法

實驗動物及設備6周齡雄性C57BL/6J小鼠(簡稱“C57小鼠”,上海斯萊科公司,許可證編號：2008001622124)；Noldus動物行為學視頻跟蹤系統(復旦大學上海醫學院神經生物研究院)；透明帶孔有機玻璃隔板及鼠籠(上海移數信息科技有限公司)；CD-1退役種鼠,雄性,4～6月齡［北京維通利華公司,許可證編號：SCXK(京2011-0011)］；SYBR Green PCR試劑盒(美國MBI公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)；real-time檢測儀(型號：ABI-7500,美國ABI公司)；生物安全柜(型號：TYPE B2,美國Sigma公司)；低溫冷凍離心機(型號：1-15K,美國Sigma公司)；手持式勻漿機(型號：F6/ 10,德國FLUKO公司)。

C57小鼠肺癌模型的建立將非小細胞肺癌系腫瘤細胞3LL培養于含10%胎牛血清的1640培養基中至對數生長期,收集腫瘤細胞,調整細胞濃度為1×107/m L,制備單細胞懸液。用1 m L空針在C57小鼠左腋皮下接種腫瘤細胞懸液,每只2× 106/0.2 m L。

動物分組將36只C57小鼠隨機分為A組(正常對照組)、B組(單純抑郁組)、C組(瘤前應激組：先應激后皮下種瘤)、D組(單純腫瘤組)、E組(瘤后應激組：先皮下種瘤后應激)、F組(5天應激組：先應激5天,種瘤后再應激5天),同時將24只CD-1退役種鼠與B、C、E、F組對應隨機分組。將各組小鼠飼養于標準SPF級環境中,使C、D、E、F組小鼠在同一天用同一批次腫瘤細胞皮下種瘤。

社交應激模型的建立將單只CD-1小鼠放于中間有透明帶孔隔板的鼠籠一側飼養,單籠飼養7天。將一只C57小鼠放入對應組CD-1小鼠鼠籠的一側,接受CD-1小鼠的刺激,5～10 min后將C57小鼠放于鼠籠中透明帶孔隔板的另一側,相處過夜24 h,同一只C57小鼠連續10天接受不同CD-1小鼠的刺激。實驗過程中,不改變CD-1小鼠所飼養的鼠籠,每天將C57小鼠放入不同CD-1小鼠鼠籠中接受刺激,建模流程見圖1。建模最后一天,所有C57小鼠單籠飼養,24 h后進行行為學檢測。

C57小鼠行為學檢測將空的透明鼠籠放于社交應激曠場邊緣的中間位置,將一只待測C57小鼠放于社交應激曠場的中央位置,打開Noldus動物運動軌跡跟蹤系統,記錄150 s內C57小鼠在曠場內的運動軌跡。取出C57小鼠,將一只未攻擊過C57小鼠的CD-1小鼠放入曠場邊緣的透明鼠籠內,將同一只C57小鼠再次放入曠場中的相同位置,再次記錄150 s內C57小鼠在曠場中的運動軌跡。每次行為學檢測結束后,用酒精棉球清理曠場及鼠籠以消除上一只小鼠留下的氣味。行為學測試結束后,CD-1小鼠和C57小鼠分別單籠飼養。

處死取材各組C57小鼠飼養31天后,眼球取血,1 500 r/min離心15 min(離心半徑5 cm),取上清保存于EP管中,-80℃凍存。將各組C57小鼠的肺組織取出,放入-80℃冰箱中凍存。剝離C、D、E、F組C57小鼠的皮下腫瘤結節,測量長短徑并稱重,同時將腫瘤組織凍存。

ELISA檢測運用ELISA方法檢測小鼠血清中VEGF的表達。按照妙通公司VEGF ELISA試劑盒的Protocol操作,全自動酶標儀在450 nm處檢測各孔的吸光度(D)值。

Westernblot檢測運用Western blot方法檢測各組小鼠肺組織中p Erk、MMP-2及MMP-9蛋白的表達。將肺組織細胞裂解,提取組織蛋白,定量和分離,轉膜后分別與相應蛋白抗體孵育并顯色。

real-timepCR檢測運用real-time PCR方法檢測肺組織中VEGFR2mRNA和L1 CAM mRNA的表達。剪取米粒大小的肺組織轉移至去核酶試管中,加入預冷的Trizol,用Trizol法提取總RNA,逆轉錄合成樣本cDNA。50μL PCR反應體系包括：realtime PCR MIX 32μL,上游、下游引物各2μL,探針1 μL,cDNA模板2μL,dd H2O 13μL。PCR反應條件為：95℃2 min,95℃15 s,60℃20 s,循環40次。

統計學處理用SPSS 16.0統計軟件對數據進行統計,采用One-way ANOVA方法進行檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

實驗流程將實驗小鼠隨機分為6組,根據不同分組在社交應激造模的不同階段給予小鼠皮下種瘤,31天后處死實驗小鼠,取材并分析,實驗流程見圖2。

各組小鼠行為學比較B、C、E、F組C57小鼠在社交區(interaction zone)和角落區(corner zone)的停留時間在應激鼠CD-1存在和不存在的情況下明顯不同,差異有統計學意義(P＜0.05,圖3)。在CD-1小鼠出現后,B、C組C57小鼠在社交區停留時間的變化尤為明顯(P＜0.01)；在CD-1小鼠存在和不存在的情況下,A、D組C57小鼠在社交區和角落區停留時間的變化不大,差異無統計學意義(P＞ 0.05)。圖3C中1、2分別是非應激組和應激組小鼠在CD-1小鼠不存在時,在社交應激曠場中的運動軌跡,圖中可見,兩組小鼠的運動軌跡在社交應激曠場中均勻分布；3、4圖分別是非應激組和應激組小鼠在CD-1小鼠存在時,在社交應激曠場中的運動軌跡,圖中可見,非應激組小鼠的運動軌跡仍均勻分布于社交應激曠場中,而應激組小鼠的運動軌跡主要分布于社交應激曠場中的右下角。

皮下腫瘤結節重量及體積變化的比較各組C57小鼠在皮下種瘤7天后,用千分尺測量小鼠皮下腫瘤的長徑(b)和短徑(a),根據公式V=b*a2/2,計算出皮下腫瘤的體積,并繪制體積變化曲線圖(圖4A)。C、F組小鼠皮下腫瘤體積的增長速度明顯高于D組和E組；C組小鼠皮下腫瘤體積的增長速度與F組小鼠比較,差異明顯；而D組與E組比較差異不大。運用多次重復測量資料的方差分析方法分析數據,球性檢驗結果不滿足協方差矩陣球對稱的條件(P＜0.01)。通過對一元分析結果進行校正,得出不同測量時相之間小鼠腫瘤體積存在差異(F=687.094,P＜0.01)的結論；不同測量時間和不同分組之間也存在著交互作用(F= 29.341,P＜0.01)。種瘤21天后,剖離皮下腫瘤結節,用電子天平稱重,比較各種瘤組小鼠腫瘤結節的重量(圖4B)。C組腫瘤結節的重量明顯高于D、E和F組,差異有統計學意義(P＜0.05)；F組與E組和D組比較,差異有統計學意義(P＜0.05)；E組與D組比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。

血清中VEGF的表達水平C、F組血清中VEGF蛋白的表達明顯高于其他各組,差異有統計學意義(P＜0.05)；D、E組血清中VEGF蛋白的表達明顯高于A、B組,差異有統計學意義(P＜0.05)；D組與E組比較,血清中VEGF蛋白的表達差異無統計學意義(P＞0.05)；C組與F組比較,血清中VEGF蛋白的表達稍高,但差異無統計學意義(P＞0.05,圖5)。

VEGFR2和L1CAM的mRNA表達水平C組C57小鼠肺組織中VEGFR2和L1CAM的m RNA表達水平明顯高于其他各組,差異有統計學意義(P＜0.05,圖6)。F組C57小鼠肺組織中VEGFR2和L1CAM的m RNA表達水平與A、B、D、E組比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。D組小鼠肺組織中VEGFR2mRNA表達水平明顯高于E組,差異有統計學意義(P＜0.05),E組肺組織中VEGFR2mRNA表達水平與A、B組比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。D、E組肺組織中L1CAM mRNA表達水平明顯高于A、B組,差異有統計學意義(P＜0.05),而B組與A組、D組與E組比較差異,無統計學意義(P＞0.05)。

肺組織中pErk、MMp-2及MMp-9蛋白的表達水平C、F組小鼠肺組織中p Erk、MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平均高于其他各組,差異有統計學意義(圖7,P＜0.05)。D組小鼠肺組織中pErk、MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平高于A、B組,差異有統計學意義(P＜0.05)；而E組與D組比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。

討 論

世界衛生組織2011年9月公布的最新數據顯示,肺癌的發病率和死亡率在全球高居榜首,肺癌已經成為一個嚴重的公共健康問題［13］。盡管現代醫學在腫瘤的治療上已經取得了很大的進步,但是即使運用先進的分子靶向治療技術,非小細胞肺癌患者的生存率仍然沒有得到很好的改善［14］。腫瘤疾病的一個顯著特點是易復發和轉移［15］,腫瘤致死的患者中超過90%死于腫瘤的復發和轉移,而非原發性腫瘤疾病本身［16］。

抑郁癥(major depression disorder,MDD)或稱抑郁障礙,是由各種原因引起的以抑郁為主要癥狀并伴有相應思維與行為改變的一組心境障礙［17］,它嚴重地影響了人們的工作和生活質量,而其具體的病因及發病機制目前尚不完全清楚。國內已有研究證明高神經質、內傾、高社會依賴性、自律自責性、完美主義人格特質及負性生活事件為MDD的高危易感因素［18］。據世界衛生組織(WHO)預測,到2020年MDD將成為僅次于缺血性心臟病的第2位致殘疾病［19］。MDD的發病多由親人死亡、夫妻離異、天災人禍等負性生活事件造成,臨床表現為情緒抑郁、多愁善感、思維遲鈍、睡眠障礙,學習工作效率低下、多疑、缺乏生活情趣,甚至有自殺傾向［20］。社交應激性抑郁動物模型模擬人類社交失敗時呈現的心理狀態,多次給予實驗動物社交失敗應激刺激,使實驗動物產生與人類抑郁癥狀相似的抑郁樣行為學改變,從而為研究人類MDD提供模型基礎。

研究證實,腫瘤患者特別是進展期或晚期腫瘤患者常伴發心理性疾病,尤其是MDD［21］。MDD不僅會降低腫瘤患者的生活質量,造成身心痛苦,使他們渴望死亡或自殺,甚至還會引起患者家屬的心理性疾病［22］。因此,為了提高腫瘤患者的治愈率、改善腫瘤患者的生活質量和心理狀態,有必要對腫瘤伴發抑郁的疾病狀態進行研究,觀察社會心理因素引起的抑郁狀態對腫瘤生長的影響,從而為腫瘤伴發心理性疾病的治療提供一定的實驗依據。

由于腫瘤患者在腫瘤發病的任何階段都有可能伴發心理性疾病,因此本實驗通過設置腫瘤發病前、發病中和發病后3個不同干預時段,觀察社交應激性抑郁對小鼠腫瘤生長的影響。實驗中將小鼠的社交應激模型與肺癌模型在不同時段相結合,分別在社交應激模型建立的10天時間里,選取3個時間點給予實驗小鼠皮下種瘤,觀察不同時段的社交應激對小鼠肺癌進展的影響。從實驗結果可以發現(如圖4),在實驗小鼠皮下種瘤之前,先給予小鼠應激刺激,會對實驗小鼠的機體即腫瘤的生長環境產生影響,而且應激對小鼠機體的影響有利于皮下腫瘤的生長。腫瘤的生長依賴于其自身血管形成和發展,VEGF是與血管生成有關的重要的特異性細胞因子［23］,VEGF通過與VEGFR結合激活細胞內一系列蛋白,使其發生二聚化和自身磷酸化而發揮生物學效應。此外, VEGF還可誘導血管內皮細胞的增殖、出芽及微血管形成［24］。因此,我們檢測了小鼠血清中VEGF蛋白的表達水平及轉移的肺組織中VEGFR2mRNA的表達水平。通過對各組實驗結果的比較(圖5、6),我們推測瘤前應激組在經過10天社交應激之后,小鼠機體免疫力已經有所下降,在此基礎上接種腫瘤細胞,機體對腫瘤細胞的免疫力不足,加上應激可能對VEGF及VEGFR的生成有一定作用,因此該組小鼠皮下腫瘤的生長速度最快。因為急性應激可以激活并增強機體的免疫防御能力,所以對于瘤后應激組,在接種腫瘤的基礎上緊接著給予社交應激刺激,這一刺激很可能增強了小鼠免疫系統對腫瘤細胞的免疫防御作用,相比其他各組,該組小鼠的腫瘤生長相關指標的表達水平最低。

腫瘤的生長和轉移是一個長期、多步驟的過程,其中最重要的一步就是對由膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白以及結締組織的蛋白聚糖等高分子化合物組成的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的降解,ECM可以被多種蛋白酶所降解,其中MMPs家族中的明膠酶類MMP-2和MMP-9是參與腫瘤細胞降解ECM、發生侵襲和轉移的主要酶類［25］。既往研究發現,腫瘤的始發和進展往往與細胞黏附分子表達水平的變化有關,這一變化可以通過增強細胞遷移的信號傳導來刺激腫瘤細胞轉移［26］。近期研究顯示,L1CAM過表達與肺癌、黑色素瘤等腫瘤的預后和轉移密切相關,L1CAM還與其他類型腫瘤的淋巴結和骨髓的微小轉移有關,這說明L1CAM在腫瘤的早期轉移擴散中發揮著重要作用。本實驗檢測了小鼠肺組織中MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平以及L1CAM mRNA的表達水平,其結果與VEGF及VEGFR所反映的結果基本相符,瘤前應激組血管生長相關分子的表達水平均高于其他各組,差異有統計學意義(P＜0.05)。

本研究發現腫瘤發生前期所伴發的抑郁狀態對腫瘤生長有促進作用。這一發現提示臨床醫師,在腫瘤伴抑郁狀態的患者接受抗腫瘤治療的同時給予抗抑郁藥物,有利于改善患者的抑郁狀態。推測社交應激對腫瘤生長的影響不僅作用于腫瘤生長相關的細胞因子的表達,還會對機體的免疫系統產生影響,但是社交應激對免疫系統的影響程度、作用的時間點及通路等問題,還有待進一步探討和研究。

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Effect of social stress in different time periods on the growth of lung cancer in mice

WU Xiao,LIU Bao-jun,WU Jin-feng,LI Bei,GONG Wei-yi, XU Hai-lin,DUAN Xiao-hong,DONG Jing-cheng△
(Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Huashan Hospital, Fudan University,Shanghai 200040,China)

Objective To observe the effect of social stress in different time periods on the growth of lung cancer in mice.MethodsThirty-six C57BL/6J mice were randomly and equally divided into group A(normal control),group B(depression group),group C(tumor before social stress group), group D(tumor group),group E(tumor after social stress group),and group F(5 daysˊsocial stress before tumor then another 5 daysˊsocial stress).On the basis of 10 daysˊsocial stress modeling,just before,during and after the social stress,we inoculated the lung cancer cells subcutaneously in C,D and E group.ELISA was used to measure the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in the serum,while Western blot was used to measure the amount of phosphorylated extracellular regulated protein kinases(p ERK),matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and matrix metalloproteinase-9(MMP-9).Real-time PCR was used to measure the amount of VEGF receptor 2(VEGFR2)mRNA%and L1 cell adhesion molecule(L1CAM).ResultsThe weight and volume of tumor nodules,as well as the expression of the above cytokines that related with tumor growth and metastasis in group C and F were much more higher than any other groups(P＜0.05).On the other hand,there was no significant difference on the weight or volume of tumor nodules,or the expression of the cytokines between group D and E(P＞0.05).ConclusionsSocial stress that occurred before and among the process of lung cancer in mice has significant effect on the growth of lung cancer,while the inner mechanism needs further research.

social stress； tumor growth； psychosocial factors； cytokines

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.002

2013-02-16；編輯：張秀峰)

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃,2009CB523001)；國家自然科學基金(81173390,81102562)；國家教育部博士點科研基金(20110071120072)

△Corresponding author E-mail：jcdong2004@126.com

*This work was supported by the National Key Basic Research program of China(973 program,2009CB523000),National Natural Science Foundation of China(81173390,81102562),Chinese Ministry of Education Fund for Doctor Discipline Scientific Research (20110071120072).