丙酮酸激酶M2型（p KM2）入核機制和核內作用的研究進展

詹 成(綜述） 時 雨 馬 軍 王 琳 王 群(審校）

(復旦大學附屬中山醫院胸外科 上海 200032)

丙酮酸激酶M2型（p KM2）入核機制和核內作用的研究進展

詹 成(綜述） 時 雨 馬 軍 王 琳 王 群△(審校）

(復旦大學附屬中山醫院胸外科 上海 200032)

傳統觀點認為丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase M2,PKM 2)通過催化腫瘤細胞糖代謝來促進腫瘤細胞生長。近年來研究發現除了酶催化功能外,PKM2還能通過多種途徑進入細胞核,在核內作為蛋白激酶廣泛參與轉錄調控、蛋白修飾等過程。本文將就這方面的研究成果作一綜述。

丙酮酸激酶M2型(PKM2)； 細胞核； 糖酵解

丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)是細胞糖酵解途徑的關鍵酶,其催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)和ADP生成丙酮酸和ATP。人體內存在4種PK同工酶,分別為L、R、M1和M2型。其中M1型和M2型均由PKM基因編碼,通過不同的外顯子剪接方式形成,兩者僅在第378位至第434位氨基酸間有23個氨基酸不同［1］。PKM2存在二聚體和四聚體兩種分子構象,并能互相轉化,其主要在胚胎細胞、成體干細胞中表達,并且隨著胚胎分化逐漸被其他3種同工酶代替,但腫瘤細胞中PKM2表達重新升高并取代原表達的PK同工酶類型［2-3］。

腫瘤細胞即使在有氧條件下,也經由糖酵解轉化大量葡萄糖生成乳酸,這一現象被稱為Warburg效應,是腫瘤細胞能量代謝最基本的改變之一。研究表明,PKM2是導致這一效應的關鍵因子［4］。

傳統觀點認為,PKM2在細胞質中與其他糖酵解酶如己糖激酶、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)等一起構成糖酵解酶復合體［5-6］。這一空間上的鄰近關系使它可以高效催化葡萄糖經由糖酵解生成乳酸和能量,而不是進入線粒體進行有氧呼吸［5,7-8］。大量糖酵解中間產物在細胞中積累,這些產物經由多種代謝途徑用于核酸、脂類和蛋白質等生物大分子的合成,而這些原料為快速生長增殖的腫瘤細胞所必需［5,9-10］。

近年來研究發現,原本定位在細胞質中的PKM2除了在能量代謝中發揮酶催化作用外,還可以通過多種途徑進入細胞核,進而廣泛參與轉錄調控、蛋白修飾等過程。

pKM2進入細胞核的機制早在1988年Gumińska等［11］就報道了在小鼠Ehrlich腹水瘤細胞和大鼠Morris肝癌細胞核提取物中發現有PKM2存在,但限于當時研究背景和條件并未對其進入細胞核的途徑進行研究。2007年Hoshino等［12］用雙雜交技術尋找小鼠原B細胞系BB13在IL-3刺激下進入細胞核的蛋白質,分別構建了含Lex A-Gal4-目標蛋白c DNA和Lex Ar結合序列-GFP的質粒并轉染BB13細胞。結果發現當轉染質粒中含PKM2序列時,IL-3刺激導致細胞核內熒光顯著增強,這說明IL-3刺激使PKM2轉入細胞核,隨后他們通過對細胞核蛋白的Western blot實驗驗證了這一點。通過構建含不同PKM2 cDNA片段的質粒,Hoshino等［12］進一步證明PKM2 C結構域的139個氨基酸殘基是導致PKM2進入細胞核能力的關鍵部分,但這部分結構并不象傳統核定位序列(Nuclear localization signal,NLS)那樣富含精氨酸和賴氨酸。Hoshino等［12］通過用非受體型酪氨酸蛋白激酶2(Janus Kinase 2,JAK 2)抑制劑AG-490處理細胞,觀察到IL-3誘導的PKM2核轉位幾乎完全被阻滯,這說明JAK 2在IL-3刺激誘導PKM2進入細胞核的過程中起著關鍵作用,但進一步的作用機制仍不明確。

Stetak等［13］在研究生長抑素誘導細胞凋亡的機制時,采用碘125標記的生長抑素類似物TT-232、蛋白質交聯劑BS3［Bis(sulfosuccinimidyl) suberate］與皮膚基底癌細胞A431提取物共同孵育,進而通過高效液相色譜-質譜技術鑒定與TT-232相互作用的蛋白質,發現TT-232能與PKM2相結合。Stetak等［13］進一步在非洲綠猴腎細胞系Cos-7中驗證TT-232及生長抑素能否特異性地與PKM2作用,并通過熒光素報告基因、免疫熒光和Western Blot技術檢驗PKM2在細胞內的分布,證實生長抑素及其類似物刺激細胞致使PKM2進入細胞核,隨后他們利用相似的技術發現H2O2、紫外線同樣能促使PKM2進入細胞核。

Spoden［14］等通過酵母雙雜交技術研究與PKM2相互作用的蛋白質,發現PIAS3(protein inhibitor of activated STAT3)通過羧基端383-619位氨基酸構成的底物結合結構域與PKM2相結合。而已知PIAS3主要是作為SUMO(small ubiquitinrelated modifier)E3連接酶起作用,參與SUMO化修飾,抑制干擾素調節因子調控蛋白1(interferon regulatory factor 1)和MITT(microphthalmiaassociated transcription factor)的轉錄活性［14-16］。在骨肉瘤細胞系U-2中進行的免疫共沉淀實驗進一步證實了PKM2能與PIAS3形成復合物［14］。Spoden等［14］處理U-2細胞以維持蛋白質的SUMO化狀態,隨后對細胞裂解液行免疫共沉淀實驗,檢測到在除正常PKM2條帶外的另一條帶；在未經維持SUMO化處理的普通Western blot實驗中,該條帶亮度大為減弱,這說明一部分PKM2確實被SUMO化修飾,但該修飾不穩定,處在不斷變化之中。上調PIAS3表達時發現SUMO化的PKM2含量只有輕微升高,這說明除了PIAS3外還有其他修飾蛋白在PKM2的SUMO化中起作用［14］。在高表達PIAS3的U-2和小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3中,利用免疫熒光雙染技術能觀察到PIAS3主要分布于細胞核中,PKM2在細胞核和細胞質中都有分布,而在普通的U-2細胞核中未觀察到PKM2存在［14］。過表達Ring結構域突變而無催化活性的PIAS3并不能促使PKM2進入細胞核,這說明該結構域在這一過程中起著重要作用［14］。

Yang等［17-18］利用免疫熒光方法發現,在人腦膠質瘤細胞U87/EGFR、U251中,表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)刺激致使PKM2在細胞核中積聚,并在人前列腺癌細胞DU145、人乳腺癌細胞MDA-MB-231中驗證了這一點。Yang等［17］分別用EGFR、磷酸肌醇3激酶、Src、JNK、MEK(MAP-kinase kinase)/ERK(extracellular regulated protein kinases)抑制劑處理細胞以阻斷EGFR、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT/PKB)、c-Src,c-Jun和ERK 1/2的磷酸化,觀察對EGF刺激所致的PKM2核轉位的影響,證實EFGR及下游ERK 1/2的激活對PKM2進入細胞核起關鍵作用。Yang等［17］還證實了ERK2通過其富含酸性氨基酸的結構域和谷氨酸天冬氨酸口袋組成的對接槽(docking groove)與PKM2第429位異亮氨酸和第431位亮氨酸組成的結構相特異性結合,兩者結合促進ERK 2對PKM2第37位的絲氨酸磷酸化；隨后,多肽脯氨酰基順反異構酶PIN 1［protein interacting with NIMA(never in mitosis A)-1］結合PKM2第37位磷酸化的絲氨酸和第38位的脯氨酸,催化PKM2該部分的順反異構,PIN1調控輸入蛋白importinα5與PKM2第399位和400位的精氨酸相結合,并最終運輸PKM2進入細胞核［17］。

pKM2在細胞核內的作用Ignacak等［19］采用親和層析提取大鼠Morris肝癌細胞核PKM2,并測定飽和底物情況下PKM2的活性,研究發現組蛋白H1和賴氨酸能明顯降低PKM2催化PEP生成丙酮酸的速率,組蛋白H1或賴氨酸能接受PEP所攜帶的高能磷酸基團,而精氨酸或組氨酸不具備這一能力。結合既往研究結果,Ignacak等［19］認為PKM2能發揮蛋白激酶的作用,把PEP上的磷酸基團轉移到組蛋白H1上富含賴氨酸的ε氨基上,通過組蛋白H1的磷酸化在DNA的復制和轉錄中發揮重要作用。

Hoshino等［12］在BB13細胞系通過轉染含NLS-PKM2 cDNA質粒來促進PKM2進入細胞核中,結果發現單獨轉染對BB13細胞的生長無顯著影響,但當在培養液中加入EGF時,細胞核中的PKM2增加顯著促進細胞生長,這說明核內的PKM2能與EGF協同發揮促細胞增殖的作用［12］。

Stetak等［13］利用表面等離子共振(surface plasmon resonance technology)等技術發現生長抑素及其類似物對PKM2的作用并不會影響PKM2的酶活性,同樣使用轉染含NLS-PKM2基因質粒的方法促進PKM2進入Cos-7細胞核,觀察到細胞凋亡,與生長抑素的作用類似,而轉染PKM2同工酶PKM1的對照組未發生細胞凋亡。這一實驗過程中未觀察到caspase-3激活,采用廣譜caspase抑制劑處理細胞也不能抑制細胞凋亡,這說明核PKM2并非通過經典的caspase途徑促進細胞凋亡［13］。Stetak等［13］將突變后喪失酶活性的PKM2 (第294位的賴氨酸突變為蛋氨酸)轉入細胞核,同樣能觀察到其促進凋亡的作用,這一實驗結果進一步證明了核內PKM2的作用不依賴于酶活性。

Lee等［20］利用GST株層析和質譜技術研究小鼠畸胎瘤細胞P19中與八聚轉錄因子4(octamerbinding transcription factor 4,Oct-4)POU DNA結合結構域相互作用的蛋白質時,發現并通過免疫共沉淀技術在人腎上皮細胞293T中進一步驗證了PKM2與Oct-4的特異性結合,隨后通過對純化的PKM2和Oct-4進行細胞外共同孵育及Western blot檢測,證明兩者直接結合而不需其他蛋白介導。對PKM2與Oct-4不同片段的研究證實,PKM2包含C結構域的307～531位氨基酸和Oct-4的POU結構域是兩者結合的關鍵部位［20］。Lee等［20］通過質粒轉染上調PKM2和Oct-4在COS-7細胞和293T細胞中的表達,并通過免疫熒光雙染技術觀察到小部分PKM2和全部Oct-4定位在細胞核中,兩者在細胞核內存在互相作用的可能；隨后在Oct-4表達上調的COS-7細胞和HeLa細胞中,通過比較上調PKM2表達與對照組含Oct-4結合位點與熒光報告基因質粒的表達情況,發現PKM2使Oct-4的轉錄活性增加了2.5倍。

Luo等［21-22］通過同位素標記和定量質譜的方法發現PKM2與HIF-1α相互結合,對缺氧培養的He La細胞核提取物行免疫共沉淀實驗,證實核PKM2與HIF-1α特異性結合。GST柱層析實驗證實PKM2能結合HIF-1α多個不同的結構域,其中包含575～786位的負調節HIF-1α轉錄活性的結構域［21-22］。Luo等［21-22］在He La細胞核肝癌細胞Hep3B中轉染融合了缺氧反應元件(hypoxia response element,HRE)和熒光報告基因的質粒,隨后通過病毒轉染上調PKM2表達,發現熒光顯著增強,而敲除PKM2則明顯降低HIF-1的轉錄活性,這兩個過程中并不伴隨HIF-1α或HIF-1β表達的變化,這說明核PKM2通過增強HIF-1的活性發揮作用。PKM2能結合HIF-1α轉錄活性結構域并促進HIF-2活性,這一功能與PKM2的酶活性無關,而PKM1沒有促進HIF活性的作用［21-22］。進一步研究證實,脯氨酸羥化酶3(prolyl hydroxylase 3,PHD3)羥化PKM2第405位和第408位的脯氨酸,促進PKM2與HIF-1α的結合,進而促進HIF-1α與HRE的結合,并且PKM2募集組蛋白乙酰化酶p300乙酰化組蛋白第9位的酪氨酸,最終促進下游基因如LDH-A、丙酮酸脫氫酶激酶1、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等的轉錄［21-22］。Luo等［21-22］還發現PKM基因第一內含子反義鏈上包含HRE元件,并證明HIF顯著促進PKM2表達,這樣就形成了一個循環促進的機制。

Gao等［23］在過表達PKM2的人結腸癌細胞SW620中采用芯片技術分析其他基因表達的變化,發現MEK 5表達較對照組升高了6倍,在SW620和SW480細胞中敲除PKM2可以導致MEK 5表達顯著降低。在多個細胞系中的研究發現,核PKM2、MEK 5與細胞增殖速度相關,敲除MEK 5可以抑制PKM2上調對細胞增殖的促進作用,但不抑制PKM2的表達,這說明MEK5在核PKM2促進細胞增殖過程中起著重要作用［23］。進一步研究證明,核PKM2在生理條件下能以PEP而不是ATP為底物,通過磷酸化信號轉導與轉錄活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3,Stat 3)第705位上的酪氨酸,促進Stat3與MEK 5啟動區域結合,進而促進MEK5的轉錄,這一磷酸化過程中不伴隨常見的磷酸化Stat3的蛋白激酶JAK 2和c-Src表達的變化［23］。Gao等［23］通過凝膠過濾層析技術發現核PKM2主要以二聚體形式存在,通過構建第399位的精氨酸突變為谷氨酸的PKM2,干擾PKM2各亞基間的連接以維持二聚體狀態的PKM2。與正常的PKM2及PKM1比較發現,二聚體PKM2能更有效地磷酸化Stat3,說明主要是二聚體PKM2發揮蛋白激酶的作用,而PKM1沒有磷酸化Stat3的作用。Stat3可競爭性結合突變型PKM2的ADP結合位點,而過表達突變型PKM2能顯著上調細胞核內的PKM2含量、Stat3磷酸化、MEK 5表達和細胞增殖［23］。

Yang等［18］在U87/EGFR細胞中采用sh RNA敲除PKM2,極大降低了細胞在基礎狀態和在EGF刺激下的增殖速度,并且顯著阻斷了EGF對周期素D1(Cyclin D1)和c-Myc表達的促進作用,而周期素D1和c-Myc是β-catenin重要的下游因子。Yang等［18］采用熒光素報告基因、免疫共沉淀和染色質免疫共沉淀技術證明,敲除PKM2可抑制EGF誘導的β-catenin激活,阻礙β-catenin與周期素D1編碼基因CCN D1(coding for cyclin D1)與c-Myc啟動子區域相結合,并抑制β-catenin與轉錄因子TCF4相結合；敲除PKM2不能阻斷Wnt 1或Wnt 3A對β-catenin轉錄活性的促進作用,說明核PKM2在EGF誘導的β-catenin激活中發揮重要作用,但這一作用并非經Wnt通路實現。隨后,Yang等［18］通過多種技術證實在EGF刺激下,EGFR下游因子c-Src轉入細胞核,磷酸化β-catenin第333位的酪氨酸,進而促進細胞核內PKM2與β-catenin相結合,兩者的結合及復合體與CCN D1啟動子區域的結合并不依賴于PKM2的酶活性。核PKM2結合在CCN D1啟動子區域,直接從PEP轉移磷酸基團磷酸化附近組蛋白H3第11位的蘇氨酸,這一作用需要PKM2的酶活性［24］。組蛋白H3在該位置的磷酸化修飾促使其與組蛋白脫乙酰化酶3(histone deacetylase,HDA C3)分離,從而促進組蛋白H3第9位的酪氨酸乙酰化,進而促進周期素D的轉錄［24］。核PKM2促進β-catenin與c-Myc啟動區域相結合,進而促進c-Myc下游基因如葡萄糖轉運體1(glucose transporter 1,GLU T1)、LDH-A等的表達,甚至通過多聚嘧啶序列結合蛋白(polypyrimidine tract binding protein,PTB)促進PKM2本身的選擇性剪接［17］。另外,β-catenin下游因子DDK1(Dickkopf 1)也是核PKM2發揮作用的途徑之一［18］。對人腦膠質瘤細胞、實驗動物和臨床病例標本的研究證實,核PKM2能促進細胞增殖、細胞從G1期轉入S期、細胞Warburg效應、腫瘤形成并與臨床分期及預后緊密相關［17-18,24］。

結語對于PKM2進入細胞核的機制及其在細胞核內的作用,近年來的研究已有較大進展。PKM2本身含有NLS序列,在多種因素作用下轉入細胞核內。細胞核內的PKM2主要發揮蛋白激酶的作用,修飾多種重要的轉錄因子,調節它們的活性和下游基因的表達,在不同條件下發揮促進或抑制腫瘤細胞生長的作用。但在PKM2進入細胞核并發揮作用的過程中仍然有許多未知環節,有待進一步的研究明確。

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A review of the mechanism of pyruvate kinase M2ˊs nuclear translocation and its function in nucleus

ZHAN Cheng,SHI Yu,MA Jun,WANG Lin,WANG Qun△
(Department of Thoracic Surgery,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai,200032,China)

Conventional views states that the pyruvate kinase M2(PKM2)enhances the growth of cancer cells via catalying glucose metabolism.However,many recent studies have reaveled that PKM2 can be translocated into nucleus where it functions more vitally than catalying though a variety of ways.As a protein kinase,PKM2 widely participants in transciptional regulation and protein modification in the nucleus.These literatures will be briefly recapitulated in this review.

pyruvate kinase M2(PKM2)； nucleus； glucolysis

Q 493.4

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.024

2012-12-28；編輯：王蔚)

高等學校博士學科點專項科研基金(20110071120066)；吳階平醫學基金(320.6750.12300)

△Corresponding author E-mail：wang.qun64@gmail.com

*This work was supported by Doctoral program Foundation of Institutions of Higher Education of China(20110071120066)and WU Jie-ping Medical Foundation(320.6750.12300).