金屬硫蛋白-2（MT-2）表達調控和蛋白相互作用研究進展

尹磊淼(綜述） 王 宇 徐玉東 魏 穎 王文倩 楊永清(審校）

(上海中醫藥大學上海市針灸經絡研究所 上海 200030)

金屬硫蛋白-2（MT-2）表達調控和蛋白相互作用研究進展

尹磊淼(綜述） 王 宇 徐玉東 魏 穎 王文倩 楊永清△(審校）

(上海中醫藥大學上海市針灸經絡研究所 上海 200030)

金屬硫蛋白-2(metallothionein-2,MT-2)作用廣泛,具有多種生物學功能。本文介紹了MT-2生物學特性、表達調控機制和蛋白相互作用等研究進展,以期對MT-2蛋白有更全面的認識,并基于某一特定疾病進行系統性研究。

金屬硫蛋白-2(MT-2)； 表達調控；蛋白相互作用

金屬硫蛋白(metallothionein,MT)最早由Margoshes和Vallee博士［1］于1957年研究金屬生物學作用時被發現,因其含有豐富巰基且能螯合大量金屬離子,故被稱為金屬硫蛋白。經金屬硫蛋白命名委員會統計的20個成員雖然普遍分子量較低,僅含有60～63個氨基酸,但半胱氨酸含量占23%～33%,且均呈保守性分布［2］。金屬硫蛋白多肽鏈不含芳香族氨基酸,但每個蛋白分子可通過半胱氨酸巰基結合7～12個金屬離子,從而具有特殊的金屬巰基化合物光譜特性［3］。哺乳動物金屬硫蛋白可分為4個亞型［4］,其中MT-1和MT-2在肺臟、大腦等全身組織和器官中表達,并且肝臟和腎臟中表達水平最高,MT-3僅在中樞神經系統和男性生殖系統表達,MT-4僅在層狀上皮細胞表達［5-6］。

MT-2是金屬硫蛋白家族中的重要成員之一,主要生理特性表現為金屬離子結合性和還原性,能與鋅、銅、鐵、鎘等二價離子可逆性結合以維持體內金屬離子平衡［3］,也可通過巰基(-SH)與機體氧自由基結合,具有較強的還原性［7］。MT-2還參與細胞增殖、凋亡、分化等生物學過程,并和癌癥、呼吸及神經系統等疾病密切相關［8-9］。本文對MT-2的生物學特性、表達調控機制和生物學效應及其與某些重大疾病的關系進行綜述。

MT-2蛋白分子生物學特性

結合二價金屬離子 人類MT-2蛋白相對分子質量(Mr)為6×103,但蛋白SDS-PAGE電泳條帶位置特殊,出現在相對分子質量為(12～15)×103區域。等電點為p H4.0,基因染色體定位于第16號染色體長臂13區,編碼61個氨基酸,其中20個為半胱氨酸［6］。金屬離子與半胱氨酸相結合形成四面體,存在于MT-2蛋白呈啞鈴狀空間結構的α和β兩個獨立功能域中［10］。MT-2蛋白結構示意圖見圖1。

結合的金屬離子在特定條件下可以解離以獲得還原狀態下Apo-MT-2。Liang等［11］將30μmol/L MT-2重組蛋白加入到含10 mmol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)的緩沖液中(10mmol/L Tris-Hcl,100 mmol/L KCl,p H=7.4),4℃孵育3 h,透析后即可去除結合的二價金屬離子和DTT。Koh等［12］將2.4 mg MT-2蛋白在0.5 mol/L HCl中孵育3 min脫去金屬離子,再通過分子篩層析回收Apo-MT-2。研究同時發現利用DTNB法檢測MT-2蛋白結合不同金屬離子親和度高低依次為：銅離子＞鉻離子＞鋅離子,而抗氧化性能強弱依次為：Apo-MT-2＞Zn-MT-2＞Cd-MT-2＞Cu-MT-2［11］。在氧化劑存在條件下,MT-2巰基和二價離子親和性降低［1］。

參與氧化應激 MT-2蛋白多肽鏈半胱氨酸除了能與金屬離子結合外,也是蛋白還原性的活性位點,能與機體氧自由基反應,清除游離活性氧,減輕細胞氧化損傷,并廣泛參與體內氧化還原反應［7］。其分子機制主要包括促自由基形成化合物能顯著增強MT-2表達,MT-2蛋白對自由基的清除及細胞抗氧化保護作用等。Bauman等［13］研究發現給予小鼠皮下注射0.1～0.5 mmol/kg百草枯(Paraquat)能使肝臟MT-2蛋白表達增強36倍。注射氮基三醋酸鐵可使肝MT-2蛋白表達在4 h內提高2.5倍,腎MT-2蛋白提高4倍［14］。表達增高的MT-2蛋白可直接清除自由基等活性基團,對肝、腎等細胞產生良好保護作用。Wang等［15］研究發現MT-2蛋白可有效抑制雙氧水對心肌細胞產生的脂質過氧化作用。腹腔注射2.5 mg/kg MT蛋白可通過促進胞內雙氧水分解,有效保護鉈元素對大鼠肝臟的氧化應激損傷［16］。MT-2還可抑制DNA氧化損傷產物8-羥基脫氧鳥苷(8-OHDG)的產生,保護細胞DNA不受破壞［17］。

MT-2蛋白誘導表達機制MT-2表達受到多種轉錄因子調節。Heuchel等［18］發現鋅、鎘等金屬離子刺激機體表達MT主要通過激活金屬反應轉錄因子1(metal-responsive transcription factor-1, MTF-1)實現。利用小鼠MTF-1基因敲除細胞,Bi等［19］研究發現環己酰亞胺可通過作用MTF-1使MT表達增加5倍以上,且呈現明顯時效和量效關系。Kelly等［20］研究認為位于MT-2基因上游1kb處和MT-1基因上游7kb處的兩個糖皮質激素反應元件可分別調控MT-1/2表達。鋅指蛋白PZ120包含POZ結構域,可與DNA序列結合參與基因表達調控,其多肽鏈被發現可特異性結合MT-2 DNA轉錄起始區序列,從而抑制啟動子的轉錄激活［21］。鋅指蛋白Sp1參與機體發育、細胞有絲分裂等表達調控,能和MT-2競爭性地結合鋅等二價離子［22］,維持Apo-MT-2在細胞內的穩定存在［23］,進而調控p53等下游信號通路［24］。其他轉錄因子如抗氧化反應元件(anti-oxidative response element,ARE)［25］,CUP1/2 (Cu-binding protein 1/2)［26］以及ras基因［27］等也被發現和MT蛋白表達密切相關。

環境中金屬離子是提高機體MT-2表達的重要因素。連續2天(每天1次)腹腔注射10 mg/kg ZnSO4可將大鼠貧化鈾損傷模型腎臟MT-2基因表達顯著提高2倍,并將死亡高峰時間平均推遲4天,生存率提高60.03%［28］。分別給予細胞不同濃度CdSO4、CuCl2和ZnSO4刺激,發現MT-2 mRNA最強表達出現在100μmol/L CuCl2處理4 h后［29］。給Caco-2細胞200μmol/L ZnSO4刺激,12 h后MT蛋白表達提高了2倍［30］。Kikuchi等［31］研究發現500μmol/L ZnCl2或50μmol/L CdCl2孵育48 h可以顯著提高MT蛋白在人星形細胞瘤細胞中表達,且IL-1(100 U/m L)中加入10μmol/L ZnCl2可有效提高其對MT蛋白誘導的表達水平。

Ghoshal等［32］發現感染流感病毒可將小鼠肝臟MT-2表達提高15～20倍,肺臟MT-2表達提高8～12倍,該效應可由IL-6、IL-10和IL-12等白細胞介素激活JAK-STAT信號通路實現,而皮質激素受體抑制劑RU-486可拮抗MT-2表達增高。此外,利用聚丙烯管限制小鼠活動12 h可將小鼠肝臟MT-2蛋白表達提高10～20倍,皮下預先注射0.5 mg RU-486可降低MT-2表達至模型組的50%,但兒茶酚胺受體阻滯劑納多洛爾對其表達無影響［33］。

MT-2蛋白相互作用分子MT-2蛋白除了離子結合性和還原性,還可以通過配體受體相互作用傳遞信號,從而介導更廣泛的生物學作用。MT蛋白發現者之一Vallee實驗室曾發現ATP可與MT蛋白1∶1結合,參與鋅離子解離和蛋白巰基二硫鍵形成等生物學過程［34］。雖然Zangger等［35］對該發現提出過質疑,但人們一直沒有停止對MT結合蛋白的探索。

Klassen等［36］利用表面等離子共振技術發現腎遠端小管細胞表面megalin受體可以和MT蛋白結合并介導對蛋白內吞攝取,MT多肽鏈序列SCKKSCC是上述反應關鍵位點。Rao等［37］利用酵母雙雜交技術發現MT-2和蛋白激酶C家族PKCmu相互作用,參與前列腺癌細胞增殖和化學耐藥性。Gon?alves等［38］利用酵母雙雜交技術發現MT-2蛋白和轉甲狀腺素蛋白存在相互作用關系,并利用競爭結合測定、免疫共沉淀、交叉耦合和免疫印跡等多種技術證明這可能是阿爾茨海默病潛在的治療靶點。Cui等［39］同樣利用酵母雙雜交技術發現食管癌相關基因2和MT-2相互作用,并利用GST pull down技術和免疫共沉淀技術加以確認。在乳腺癌上皮細胞中,野生型和突變無活性P53蛋白均能和MT蛋白相結合,參與細胞凋亡等生物學過程［40］。Xia等［41］也利用表面等離子共振技術證實P53和Apo-MT存在直接結合作用。

利用在線生物信息學基因蛋白相互作用檢索工具STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes and Proteins,http：//string. embl.de),我們對MT-2潛在的直接或間接相互作用蛋白進行搜索和預測,發現該蛋白可能和基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9),褪黑素受體1B(melatonin receptor 1B,MTNR1B)和G蛋白偶聯受體50(G protein-coupled receptor 50,GPR50)等存在相互作用關系(圖2),這為進一步研究MT-2蛋白機制提供了新的線索。

MT-2蛋白參與癌癥、呼吸系統疾病等多種重大疾患MT-2蛋白是多種癌癥標記物并參與腫瘤發生、發展和調控［9］。Goulding等［42］分析100例原發性乳腺癌患者病理資料發現MT蛋白高表達和乳腺癌腫瘤類型、復發以及預后等密切相關。Martano等［43］利用免疫組化技術發現MT表達和分泌腺腫瘤發病密切相關,可能是潛在診斷標記物。MT-2蛋白在非小細胞肺癌組織中表達顯著性增強,結合Ki-67和微小染色體支持蛋白2(minichromosome maintenance protein-2,MCM-2)可對疾病預后作出判斷［44］。利用MT-1/2基因敲除小鼠模型,Majumder等［45］研究發現MT蛋白能有效保護肝損傷并降低肝癌發生率。

MT-2蛋白參與呼吸系統疾病多種生理病理過程。Inoue等［46］利用雞卵蛋白致敏野生型和MT基因敲除小鼠,激發后24 h觀察發現肺泡灌洗液中IL-1β、嗜酸細胞活化趨化因子等表達顯著增強。Takano等［47］認為MT基因敲除小鼠比野生型小鼠更容易發生肺部炎癥和肺水腫。在鎳誘導肺損傷模型中,MT轉基因小鼠平均生存時間為124.8 h,明顯高于對照組103.4 h和MT基因敲除組84.8 h,基因表達譜研究發現潛在機制涉及炎癥控制、纖維化和肺表面活性物質平衡等生物學過程［48］。

小結MT-2作用廣泛,涉及多種生物學過程并參與機體多種重大疾病的發生,在今后的研究中需要在效應機制和臨床應用中給予更多關注。應整合生物信息學、生物化學和分子生物學等方法和技術,進一步研究其蛋白功能、表達調控和相互作用機制,以期對MT-2蛋白有更全面認識,并基于某一特定疾病進行系統性研究。

［1］ Jiang LJ,Maret W,Vallee BL.The glutathione redox couple modulates zinc transfer from metallothionein to zinc-depleted sorbitol dehydrogenase［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(7)：3483-3488.

［2］ Capdevila M,Atrian S.Metallothionein protein evolution：a miniassay［J］.J Biol Inorg Chem,2011,16(7)：977 -989.

［3］ Sutherland DE,Stillman MJ.The magic numbers of metallothionein［J］.Metallomics,2011,3(5)：444-463.

［4］ Kayaalti Z,Aliyev V,Soylemezoglu T.The potential effect of metallothionein 2A-5 A/G single nucleotide polymorphism on blood cadmium,lead,zinc and copper levels［J］.Toxicol Appl Pharm,2011,256(1)：1-7.

［5］ Thirumoorthy N,Shyam A,Manisenthil K,et al.A review of metallothionein isoforms and their role in pathophysiology［J］.World J Surg Oncol,2011,9：54.

［6］ Hidalgo J,Aschner M,Zatta P,et al.Roles of the metallothionein family of proteins in the central nervous system［J］.Brain Res Bull,2001,55(2)：133-145.

［7］ Swindell WR.Metallothionein and the biology of aging［J］.Ageing Res Rev,2011,10(1)：132-145.

［8］ Ebadi M,Sharma S.Metallothioneins 1 and 2 attenuate peroxynitrite-induced oxidative stress in Parkinson disease［J］.Exp Biol Med,2006,231(9)：1576-1583.

［9］ Thirumoorthy N,Manisenthil KT,Shyam A,et al. Metallothionein：an overview［J］.World J Gastroentero, 2007,13(7)：993-996.

［10］ Haq F,Mahoney M,Koropatnick J.Signaling events for metallothionein induction［J］.Mutat Res,2003,533(1-2)：211-226.

［11］ Liang SH,Jeng YP,Chiu YW,et al.Cloning,expression, and characterization of cadmium-induced metallothionein-2 from the earthworms Metaphire posthuma and Polypheretima elongata［J］.Comp Biochem Phys C,2009, 149(3)：349-357.

［12］ Koh M,Kim HJ.The effects of metallothionein on the activity of enzymes involved in removal of reactive oxygen species［J］.Bull Korean Chem Soc,2001,22(4)：362 -366.

［13］ Bauman JW,Madhu C,Mc Kim JM,et al.Induction of hepatic metallothionein by paraquat［J］.Toxicol Appl Pharm,1992,117(2)：233-241.

［14］ Min KS,Morishita F,Tetsuchikawahara N,et al. Induction of hepatic and renal metallothionein synthesis by ferric nitrilotriacetate in mice：the role of MT as an antioxidant［J］.Toxicol Appl Pharm,2005,204(1)：9 -17.

［15］ Wang GW,Schuschke DA,Kang YJ.Metallothioneinoverexpressing neonatal mouse cardiomyocytes are resistant to H2O2 toxicity［J］.Am J Physiol,1999,276(1 Pt 2)：H167-H175.

［16］ Kilic GA,Kutlu M.Effects of exogenous metallothionein against thallium-induced oxidative stress in rat liver.Food Chem Toxicol,2010,48(3)：980-987.

［17］ Min KS,Horie T,Tetsutchikawahara N,et al. Metallothionein suppresses the gormation of 8-hydroxy-2ˊ-deoxyguanosine in DNA induced by ferric nitrilotriacetate in vitro［J］.J Health Sci,2005,51(4)：497-503.

［18］ Heuchel R,Radtke F,Georgiev O,et al.The transcription factor MTF-1 is essential for basal and heavy metalinduced metallothionein gene expression［J］.EMBO J, 1994,13(12)：2870-2875.

［19］ Bi Y,Lin GX,Millecchia L,et al.Superinduction of metallothionein I by inhibition of protein synthesis：role of a labile repressor in MTF-1 mediated gene transcription［J］.J Biochem Mol Toxicol,2006,20(2)：57-68.

［20］ Kelly EJ,Sandgren EP,Brinster RL,et al.A pair of adjacent glucocorticoid response elements regulateexpression of two mouse metallothionein genes［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94(19)：10045-10050.

［21］ Tang CM,Westling J,Seto E.Trans repression of the human metallothioneinⅡA gene promoter by PZ120,a novel 120-kilodalton zinc finger protein［J］.Mol Cell Biol, 1999,19(1)：680-689.

［22］ Posewitz MC,Wilcox DE.Properties of the Sp1 zinc finger 3 peptide：coordination chemistry,redox reactions,and metal binding competition with metallothionein［J］.Chem Res Toxicol,1995,8(8)：1020-1028.

［23］ Rana U,Kothinti R,Meeusen J,et al.Zinc binding ligands and cellular zinc trafficking：apo-metallothionein, glutathione,TPEN,proteomic zinc,and Zn-Sp1［J］.J Inorg Biochem,2008,102(3)：489-499.

［24］ Takahashi S.Molecular functions of metallothionein and its role in hematological malignancies［J］.J Hematol Oncol,2012,5：41.

［25］ Carthew RW,Chodosh LA,Sharp PA.The major late transcription factor binds to and activates the mouse metallothionein I promoter［J］.Genes Dev,1987,1(9)：973 -980.

［26］ Buchman C,Skroch P,Welch J,et al.The CUP2 gene product,regulator of yeast metallothionein expression,is a copper-activated DNA-binding protein［J］.Mol Cell Biol, 1989,9(9)：4091-4095.

［27］ Schmidt CJ,Hamer DH.Cell specificity and an effect of ras on human metallothionein gene expression［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,1986,83(10)：3346-3350.

［28］ Hao Y,Ren J,Liu J,et al.The protective role of zinc against acute toxicity of depleted uranium in rats［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol,2012,111(6)：402-410.

［29］ Said Ali K,Ferencz A,Nemcsok J,et al.Expressions of heat shock and metallothionein genes in the heart of common carp(Cyprinus carpio)：effects of temperature shock and heavy metal exposure［J］.Acta Biol Hung, 2010,61(1)：10-23.

［30］ Shen H,Qin H,Guo J.Cooperation of metallothionein and zinc transporters for regulating zinc homeostasis in human intestinal Caco-2 cells［J］.Nutr Res,2008,28(6)：406 -413.

［31］ Kikuchi Y,Irie M,Kasahara T,et al.Induction of metallothionein in a human astrocytoma cell line by interleukin-1 and heavy metals［J］.FEBS Lett,1993,317 (1-2)：22-26.

［32］ Ghoshal K,Majumder S,Zhu Q,et al.Influenza virus infection induces metallothionein gene expression in the mouse liver and lung by overlapping but distinct molecular mechanisms［J］.Mol Cell Biol,2001,21(24)：8301 -8317.

［33］ Ghoshal K,Wang Y,Sheridan JF,et al.Metallothionein induction in response to restraint stress.Transcriptional control,adaptation to stress,and role of glucocorticoid［J］. J Biol Chem,1998,273(43)：27904-27910.

［34］ Jiang LJ,Maret W,Vallee BL.The ATP-metallothionein complex［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(16)：9146 -9149.

［35］ Zangger K,Oz G,Armitage IM.Re-evaluation of the binding of ATP to metallothionein［J］.J Biol Chem,2000, 275(11)：7534-7538.

［36］ Klassen RB,Crenshaw K,Kozyraki R,et al.Megalin mediates renal uptake of heavy metal metallothionein complexes.Am J Physiol Renal,2004,287(3)：F393 -F403.

［37］ Rao PS,Jaggi M,Smith DJ,et al.Metallothionein 2A interacts with the kinase domain of PKCmu in prostate cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun,2003,310(3)：1032-1038.

［38］ Goncalves I,Quintela T,Baltazar G,et al.Transthyretin interacts with metallothionein 2［J］.Biochemistry,2008, 47(8)：2244-2251.

［39］ Cui Y,Wang J,Zhang X,et al.ECRG2,a novel candidate of tumor suppressor gene in the esophageal carcinoma, interacts directly with metallothionein 2A and links to apoptosis［J］.Biochem Biophys Res Commun,2003,302 (4)：904-915.

［40］ Ostrakhovitch EA,Olsson PE,Jiang S,et al.Interaction of metallothionein with tumor suppressor p53 protein［J］. FEBS Lett,2006,580(5)：1235-1238.

［41］ Xia N,Liu L,Yi X,et al.Studies of interaction of tumor suppressor p53 with apo-MT using surface plasmon resonance［J］.Anal Bioanal Chem,2009,395(8)：2569 -2575.

［42］ Goulding H,Jasani B,Pereira H,et al.Metallothionein expression in human breast cancer［J］.Br J Cancer,1995, 72(4)：968-972.

［43］ Martano M,Carella F,Squillacioti C,et al. Metallothionein expression in canine cutaneous apocrine gland tumors［J］.Anticancer Res,2012,32(3)：747-752.

［44］ Werynska B,Pula B,Muszczynska-Bernhard B,et al. Correlation between expression of metallothionein and expression of Ki-67 and MCM-2 proliferation markers in non-small cell lung cancer［J］.Anticancer Res,2011,31 (9)：2833-2839.

［45］ Majumder S,Roy S,Kaffenberger T,et al.Loss of metallothionein predisposes mice to diethylnitrosamineinduced hepatocarcinogenesis by activating NF-kappaB target genes［J］.Cancer Res,2010,70(24)：10265-10276.

［46］ Inoue K,Takano H,Yanagisawa R,et al.Role of metallothionein in antigen-related airway inflammation［J］.Exp Biol Med,2005,230(1)：75-81.

［47］ Takano H,Inoue K,Yanagisawa R,et al.Protective role of metallothionein in acute lung injury induced by bacterial endotoxin［J］.Thorax,2004,59(12)：1057-62.

［48］ Wesselkamper SC,McDowell SA,Medvedovic M,et al. The role of metallothionein in the pathogenesis of acute lung injury［J］.Am J Respir Cell Mol Biol,2006,34(1)：73-82.

The research progress of gene expression regulation and protein-protein interaction of metallothionein-2（MT-2）

YIN Lei-miao,WANG Yu,XU Yu-dong,WEI Ying,WANG Wen-qian,YANG Yong-qing△
(Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200030,China)

Metallothionein-2(MT-2)is a protein with a variety of biological functions.This article describes the biological characteristics,expression regulation mechanisms and protein interaction studies of MT-2,which lays a solid foundation for further comprehensive study of the protein in a particular disease.

metallothionein-2(MT-2)； expression regulation； protein-protein interaction

Q 51

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.022

2012-11-30；編輯：張秀峰)

國家自然科學基金(81001548,8117334,81173332,81202753)；上海市青年科技啟明星計劃(12QA1403000)；上海市教委和上海市教育發展基金會“晨光計劃”資助項目(10CG45)；上海市衛生系統優秀青年人才培養計劃(XYQ2013081)

△Corresponding author E-mail：dryqyang@163.com

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81001548,8117334,81173332,81202753)；Shanghai Rising-Star program(12QA1403000)；“Chen Guang”project supported by Shanghai Municipal Education Commission and Shanghai Education Development Foundation(10CG45),and Science Foundation for the Excellent Youth Scholars of Shanghai Health System(13Y065).