不同比例聚乳酸-聚己內酯/泊洛沙姆靜電紡納米材料作為皮膚支架的可能性

劉寧華繆月娥亓發芝 顧建英△

(1復旦大學附屬中山醫院整形外科 上海 200032；2復旦大學高分子科學系聚合物分子工程國家重點實驗室 上海 200433)

不同比例聚乳酸-聚己內酯/泊洛沙姆靜電紡納米材料作為皮膚支架的可能性

劉寧華1繆月娥2亓發芝 顧建英1△

(1復旦大學附屬中山醫院整形外科 上海 200032；2復旦大學高分子科學系聚合物分子工程國家重點實驗室 上海 200433)

目的探討不同比例聚乳酸-聚己內酯/泊洛沙姆［poly(ε-caprolactone-co-lactide)/Poloxamer,PLCL/ Poloxamer］靜電紡材料作為皮膚組織支架的可能性。方法靜電紡絲技術制備純PLCL及PLCL/Poloxamer比例75/25、85/15、90/10、95/5的納米纖維材料,測定支架表面形態、機械以及親水性能。將脂肪干細胞接種至支架表面,第1、3、7、10天行水溶性四唑鹽(CCK-8)分析,并于第3天掃描電鏡觀察細胞形態。結果90/10、95/ 5比例支架的斷裂強度高于純PLCL及75/25、85/15比例支架(分別為9.31±0.29,9.27±0.50,7.08±0.21, 7.46±0.27和7.47±0.21,MPa),90/10、85/15、75/25比例的水接觸角低于純PLCL及95/5比例(分別為0°, 0°,0°,131.5°±8.9°和7.8°±2.7°)。在第1、3、7、10天時,PLCL/Poloxamer材料脂肪干細胞黏附及增殖能力明顯高于純PLCL。掃描電鏡顯示90/10比例PLCL/Poloxamer支架上有大量脂肪干細胞生長,細胞形態完整、表面光滑。結論90/10比例PLCL/Poloxamer支架的機械性能及親水性能高于其他組,該材料與大鼠脂肪干細胞的相容性良好,是更適合脂肪干細胞黏附及增殖的組織工程材料。

脂肪干細胞； 靜電紡絲； 皮膚； 聚乳酸-聚己內酯/泊洛沙姆； 掃描電鏡

對于嚴重燒傷或機械傷致大面積的皮膚組織缺損,目前臨床上常采用自體皮瓣或皮片移植來進行修復,但是由于自體皮瓣或皮片的組織量有限,尚無法滿足臨床的應用。因此,臨床上常采用人工組織工程皮膚來修復。采用靜電紡絲技術構建的組織工程支架厚度可在0.05～2 mm之間,與皮膚表皮層及真皮層的厚度一致,這使得靜電紡的材料在幾何尺寸上與細胞外基質的微觀結構存在一致性［1-2］。聚乳酸-聚己內酯［poly(ε-caprolactone-co-lactide, PLCL)］是一種人工合成的高分子聚合材料,它取材廣泛、容易降解,同時具有良好的柔韌性、抗磨損性和一定的機械強度,近年來被較廣泛地應用于組織工程的支架［3-4］。但PLCL親水性不夠,尋找一

種材料與之共紡成為必要。泊洛沙姆(Polomaxer)是聚氧乙烯共聚物,是一類新型的高分子離子表面活性劑,常用作藥物輔劑,其毒性小、無色,具有兩端親水、中間疏水的特性［5-6］。我們采用靜電紡絲技術制備純PLCL及比例為75/25、85/15、90/10、95/ 5的PLCL/Poloxamer納米纖維材料,檢測支架表面形態、機械性能以及親水性等特性,并將脂肪干細胞(adipose-derived stem cell,ADSCs)接種在不同配比的靜電紡納米支架上,體外觀測其生物組織相容性,篩選一種最佳配比的PLCL/Polomaxer納米材料,以期作為修復皮膚創面的組織工程材料。

材料和方法

儀器試劑PLCL(聚乳酸-聚己內酯,山東濟南岱罡生物科技有限公司公司,其聚乳酸與聚己內酯比值為7∶3)。Polomaxer(泊洛沙姆,復旦大學材料學院提供)。靜電紡絲設備(Onizuka Glass公司,日本),攪拌器(BT124 S,北京賽多利斯),拉力測試儀(CMT8501型,深圳新三思集團),水接觸角測試儀(OCA40,Dataphysics,德國),掃描電子顯微鏡(JSM-5600LV,日本),酶標儀(RT-6000,美國),正置、倒置相差顯微鏡(Olympus公司,日本)。磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素雙抗和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(1∶1)(中國吉諾生物有限公司)。低糖DMEM培養基、胎牛血清(FBS)(Gibco公司)。CCK-8(日本同仁化學研究所)。六氟異丙醇、Ⅰ型膠原酶、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)。

脂肪干細胞原代培養脂肪干細胞來自復旦大學上海醫學院動物實驗中心提供的SD大鼠,按照Yoshimura等［7］介紹的方法,常規備皮、消毒、鋪巾,用20號刀片平行于腹股溝方向切開皮膚,眼科剪將腹股溝脂肪分離并取出,置于無菌生理鹽水中,并盡快分離細胞。在顯微鏡下將脂肪組織內的小血管挑取出來,置于玻璃板上,用眼科剪反復裁剪成1 mm3大小的碎片。移入消化瓶后加入4倍體積的0.1%I型膠原酶,搖勻密封后置入37°的恒溫搖床中消化1 h。消化結束后,用200目濾網過濾未消化組織碎片,將濾液移入15 m L離心管中400×g離心5 min,棄上清液,加入7～8 m L PBS吹勻細胞后400 ×g再次離心5 min,棄上清液后吸取低糖DMEM 4～5 m L(10%胎牛血清,青霉素和鏈霉素含量100U/m L)滴入離心管吹打細胞,將細胞移入25 cm2培養瓶中并置于37℃,5%CO2培養箱內孵育過夜。2天換一次液,原代培養第6天時細胞達到80%融合,用0.25%胰酶-0.02%EDTA(1∶1)消化傳代。第3代為目的細胞,即脂肪干細胞。

pLCL/polomaxer靜電紡絲納米材料制備將各比例的PLCL、Polomaxer溶解在六氟異丙醇溶劑中,在磁力攪拌器下溶解4～6 h成穩定均一透明的溶液,靜置30 min后備用。共混靜電紡絲實驗在室溫下進行,將紡絲液吸入1支1.0 m L或2.5 m L的注射器,注射器金屬針頭內徑為0.42～0.58 mm,通過包有絕緣皮的電線和鐵頭將靜電高壓發生器(可以提供0～50 k V的直流電壓)和針頭連接起來,將一片鉆箔用雙面膠粘到硬紙板上,然后放置到針頭正下方12～15 cm處,作為接地的接收器,用于接收靜電紡纖維。在高電壓作用下,紡絲液在電場中噴射形成纖維沉積在接收器上,形成纖維膜。

支架掃描電鏡檢測將收集在鋁箔上的靜電紡纖維試樣鍍金90 s,然后在10 k V加速電壓下,用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀察靜電紡纖維的形態并拍照。為了統計不同樣品的納米直徑分布范圍,將所得的SEM圖像用圖像分析軟件Image J對制備的納米纖維進行直徑測量。

支架力學性能測定將電紡所得的厚度一定(100μm)、不同比例的PLCL/Polomaxer電紡膜裁成5 mm×50 mm的長條形樣條,在拉伸儀上于室溫下進行單軸拉伸試驗,微調機頭位置待電紡材料略微張緊后開始拉伸測試。拉伸速度為20 mm/ min。重復檢測5個樣本。

支架水接觸角測定采用100μm平整的不同比例的PLCL/Polomaxer材料,測試時水滴體積為3μL,測試環境為室溫。通過光學顯微鏡的攝像頭觀察水滴在片材表面的變化情況,接觸角由圖象分析軟件自動測定。選用的測定頻率為2 Hz,得到樣品的水接觸角情況。重復檢測5個樣本。

靜電紡絲支架的細胞種植將支架材料均剪成直徑為7 mm的圓形支架,紫外燈照射1 h后,浸泡于75%酒精中消毒12 h,取出后用PBS反復沖洗3次,每次5 min,晾干備用。將圓形支架置于96孔板內,鋪平于孔板底,加入50μL低糖DMEM預濕12 h。調節細胞濃度為5×104/m L,吸取20μL細胞懸液加在材料表面,并充分搖勻,使得細胞懸液能接觸到材料的所有表面,同時空白孔加入細胞懸液20μL作為對照,然后將孔板置于37℃,5%CO2培養箱內孵育,4 h后加入低糖DMEM(10%FBS, 100 U/m L青霉素和鏈霉素)80μL繼續培養,隔天更換培養液。

CCK-8檢測從加入細胞懸液開始計時,分別在細胞培養的第1、3、7和10天加入10μL CCK-8反應液,置于37℃,5%CO2培養箱內孵育4 h,震蕩混勻后從各孔內吸取出混合液體100μL轉入另外的96孔板內,用酶聯免疫檢測儀測量450 nm處吸光度(D)值,第1天和第3天數值反應細胞與支架的黏附情況,第7天和第10天數值反應細胞在支架上的增殖情況。每個樣品設置3個復孔。實驗重復3次。

ADSCs與pLCL/polomaxer體外培養掃描電鏡觀察脂肪干細胞與純PLCL、85/15、90/10、95/5 PLCL/Polomaxer材料培養3天后取出,采用鋨酸固定,丙酮梯度脫水的方法處理樣品,預冷臨界點干燥儀將樣品干燥后,用導電膠將樣品固定在電鏡臺上。噴金后(10 m A,90 s)在真空掃描電鏡上進行細胞的形態觀察。

統計學分析各項定量指標均以x—±s的形式表示,應用SPSS 16.0軟件包對各定量指標進行統計學分析,不同材料組之間的各觀察值用單因素方差分析(ANOVA),比較不同時間點不同組間的各觀察值采用單個重復測量因素方差分析(analysis of variance of repeated measures data),多重比較采用最小顯著差值法(Least-significant difference, LSD)。當P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

不同配比pLCL與polomaxer掃描電鏡及纖維直徑檢測掃描電鏡結果見圖1 A-E,可見所得靜電紡絲材料纖維表面光滑。除PLCL/Polomaxer比例75/25支架出現纖維融合外,其余各組纖維形態清晰,且直徑的變異系數變化不大。通過Image J軟件測量支架纖維直徑,75/25 PLCL/Polomaxer纖維直徑為(2.74±1.22)μm,明顯大于PLCL、85/ 15、90/10和95/5組支架［分別為(1.58±0.47) μm、(1.60±0.65)μm、(1.55±0.39)μm和(1.61 ±0.52)μm,P＜0.05］,差異具有統計學意義；其余各組的纖維直徑差異無明顯統計學意義。

不同配比pLCL與polomaxer力學性能測量結果力學性能檢測結果提示不同配比PLCL與Polomaxer的力學測量提示各組分之間的拉伸模量差異并無統計學意義,且均在正常皮膚范圍以內。90/10、95/5的PLCL/Polomaxer的拉伸強度均大于單純PLCL、75/25、85/15等組,差異存在顯著性,但這兩組之間差異無統計學意義,各組分的拉伸強度均在正常皮膚范圍以內。90/10、95/5的PLCL/ Polomaxer的斷裂伸長率兩者差異無統計學意義,但均大于PLCL組,小于75/25、85/15等組,各組的斷裂伸長率均高于正常皮膚范圍(表2)。

不同配比pLCL與polomaxer水接觸角測量結果水接觸角測量結果提示純PLCL材料的接觸角為131.5°±8.9°；75/25、85/15及90/10的水接觸角為0°；95/5水接觸角為7.8°±2.7°(圖2)。

CCK-8檢測ADSCs在PLCL/Polomaxer各組支架上培養后第1天,Control、PLCL、75/25、85/ 15、90/10、95/5等組的D值分別為0.20±0.06、0.19±0.04、0.35±0.11、0.33±0.05、0.35±0.16、0.31±0.09。培養后第3天,D值分別為0.44± 0.08、0.36±0.10、0.67±0.16、0.64±0.09、0.69± 0.07、0.59±0.16。培養后第7天,D值分別為1.13 ±0.14、0.78±0.21、1.47±0.11、1.51±0.21、1.54 ±0.23、1.49±0.17。培養后第10天,D值分別為1.47±0.09、1.23±0.16、1.73±0.10、1.79±0.35、1.72±0.33、1.80±0.18(圖3)。

采用重復測量的方差分析進行檢驗,發現培養不同時間時,不同方法間的結果存在差別(F=18.308, P＜0.01)。通過LSD兩兩比較,Control組與PLCL組和75/25、85/15、90/10、95/5等組的D值之間存在差異,P值分別為0.019,0.01,0.01,0.01,0.02；

(1)vs.PLCL and control group；(2)vs.PLCL group,P＜0.05.Cell number of ADSCs on 75/25,85/15,90/10 and 95/5 PLCL/Polomaxer is greater than PLCL and control group at day 1, 3,7 and 10；Cell number of ADSCs on control group is greater than PLCL group at day 3,7and 10. PLCL組與75/25、85/15、90/10、95/5等組的D值之間存在差異,P值均＜0.01；75/25、85/15、90/10、95/ 5等組的D值之間的差異不具有統計學意義,P值均＞0.05。

ADSCs在pLCL/polomaxer材料上的掃描電鏡觀察結果ADSCs在純PLCL、85/15、90/10、95/5 PLCL/Polomaxer納米材料上培養第3天時,將細胞與支架的共培養物取出行掃描電鏡觀察(圖4),結果顯示純PLCL上面的干細胞形態聚縮,并未完全展開,表示純PLCL與細胞的親和力不佳。PLCL/ Poloxamer 85/15、90/10、95/5比例材料上的細胞形態學并無明顯區別,細胞形態呈長梭形或多邊形,表面光滑,形態完整,伸出較多足突與材料黏附緊密,細胞之間也已經通過偽足聯系起來。

討 論

近年組織工程技術的進步、組織工程皮膚的不斷完善,為大面積皮膚缺損和慢性創面修復提供了新的途徑,探索一種接近正常皮膚物理和生理特性的人工皮膚成為必要。PLCL是聚乳酸-聚己內酯混合制成的有機高分子材料,大多數研究者認為比值7∶3是較好的機械性能［8-9］。本實驗結果顯示PLCL的接觸角為131.5°±8.9°,親水性較差,故水等電解質不易

透過。Polomaxer是聚氧丙烯與聚氧乙烯的共聚物,是一類新型的高分子離子表面活性劑,目前常用作藥

物的乳化劑、穩定劑、增溶劑和吸收促進劑等［10-11］,且來源廣泛、價格低廉、容易獲取,因此本實驗擬采用高分子的Polomaxer與PLCL共紡納米支架。本實驗結果提示PLCL/Polomaxer比例75/25支架出現較嚴重的纖維融合,因此75/25不宜作為本實驗的組織工程支架材料。進一步選取PLCL/Polomaxer比例95/5、90/10、85/15作為皮膚組織工程的支架材料。

理想的人工皮膚要求具有良好的生物組織相容性和表面活性,并且需要一定的可塑性、機械拉伸強度及抗磨損特性［12-13］。本實驗發現PLCL與Polomaxer共紡的納米材料纖維表面光滑,85/15、90/ 10及95/5比例的共紡支架纖維直徑分布均勻,且并未出現纖維融合的情況。材料的力學性能測定顯示靜電紡納米材料均具有較好的拉伸模量和拉伸強度,其中90/10及95/5比例的共紡支架拉伸強度最好,不易斷裂,與正常皮膚最為接近。水接觸角的測定提示Polomaxer的加入可明顯改善PLCL的親水性能,其中75/25、85/15、90/10比例共紡后水接觸角均為0°,而95/5的水接觸角為7.8°±2.7°,提示其親水性比其他3種稍差。CCK-8結果提示75/25、85/15、90/ 10及95/5比例的共紡支架上ADSCs的黏附增殖性能均明顯高于純PLCL組,但各比例共紡支架之間差異并無統計學意義。綜上因素,90/10比例PLCL與Polomaxer共紡靜電紡納米材料可能更與皮膚的特性接近。該支架與ADSCs共培養3天后的掃描電鏡發現ADSCs形態完整、表面光滑、伸出較多足突與材料黏附緊密,而細胞形態學表現是反映細胞親和力的直接證據［14］。提示90∶10 PLCL/Polomaxer共紡靜電紡納米材料可以用作組織工程支架覆蓋創面,能促使種子細胞吸附,細胞因子和組織液容易透過支架,營養種子細胞,從而可以促進創面愈合。

組織工程皮膚的目標是應用于臨床,促進創面愈合的同時發揮屏障防護作用是其目標。嚴重燒傷、機械傷所致大面積皮膚組織缺損一直是創面愈合研究領域的熱點難點,新型的組織工程皮膚有望實現大面積創面治療領域的新突破。本實驗研討不同比例PLCL/Polomaxer靜電紡納米材料作為組織工程皮膚的可行性研究,是新型的組織工程材料PLCL/ Polomaxer復合脂肪干細胞修復大面積皮膚創面研究的重要組成部分,兩者相容性的確立可為下一步的成表皮誘導及動物實驗提供實驗基礎。

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The possibility of different proportions of electrospun nanomaterials p LCL/poloxamer as a skin tissue substitute

LIU Ning-hua1,MIAO Yue-e2,QI Fa-zhi1,GU Jian-ying1△
(1Department of Cosmetic and Reconstructive Surgery,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China；
2State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers-Department of Macromolecular Science, Fudan University,Shanghai 200433,China)

Objective To investigate the possibilities of different proportion of poly(ε-caprolactoneco-lactide)/Poloxamer(PLCL/Poloxamer)scaffolds work as a skin tissue engineering substitute.MethodsElectrospinning pure PLCL and PLCL/Poloxamer ratio of 75/25,85/15,90/10,95/5 nanofibers were prepared,and their surface morphology,mechanical and hydrophilic properties were measured.The adipose stem cells(ADSCs)were seeded on the scaffolds surface,and the scaffolds biologically activities with ADSCs were determined through water-soluble tetrazolium salt test(CCK-8)on day 1,3,7,10.Scanning electron microscopy was applied to observe the ADSCs morphology on day 3.ResultsThe nanofiber scaffoldsˊbreaking strength of 90/10 and 95/5 ratio was higher thanpure PLCL and 75/25,85/15 ratio(9.31±0.29,9.27±0.50,7.08±0.21,7.46±0.27,and 7.47± 0.21 MPa,respectively),and the water contact angle of 90/10,75/25,85/15 ratio was less than pure PLCL and 95/5 ratio(0°,0°,0°,131.5°±8.9°,and 7.8°±2.7°,respectively).On day 1,3,7,10,the adhesion and proliferation of ADSCs on PLCL/Poloxamer material was significantly higher than pure PLCL.Scanning electron microscopy showed that the 90/10 PLCL/Poloxamer scaffolds had a lot of ADSCs,the cells had complete cell morphology and smooth surface.Conclusions90/10 ratio of PLCL/Polomaxer had better mechanical properties and hydrophilicity than other groups,and the compatibility with ADSCs was better than pure PLCL.Therefore,90/10 ratio of PLCL/Polomaxer is more suitable tissue engineering material for skin tissue engineering.

adipose-derived stem cells； electrospinning； skin； PLCL/Poloxamer； scanning electron microscopy

R 628

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.006

2013-07-08；編輯：沈玲)

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃,2009CB930000)

△Corresponding author E-mail：gu.jianying@zs-hospital.sh.cn

*This work was supported by the National Key Basic Research program of China(2009CB930000)