Skp2在鼻型NK/T細胞淋巴瘤中的表達及臨床意義

邢 岳王紓宜△許祖德

(1復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院病理科 上海 200031；2復旦大學附屬華山醫院病理科 上海 200040)

Skp2在鼻型NK/T細胞淋巴瘤中的表達及臨床意義

邢 岳1王紓宜1△許祖德2

(1復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院病理科 上海 200031；2復旦大學附屬華山醫院病理科 上海 200040)

目的探討Skp2與鼻型NK/T細胞淋巴瘤的預后及其他臨床特點之間的關系。方法收集95例鼻型NK/T細胞淋巴瘤患者臨床病理學資料,用免疫組化方法檢測腫瘤石蠟包埋標本的EB病毒編碼RNA(EBV encoded RNA,EBER)、Skp2及Ki-67的表達情況,將Skp2陽性細胞比率超過50%的病例計入高表達組,低于50%的計入低表達組,分析患者的預后、EBER表達狀態與Skp2、Ki-67表達率之間的關系。結果在Skp2高表達組,中位生存期為20.54個月(95%CI：18.49-22.59),1年總體生存率為76%；在Skp2低表達組,中位生存期為17.54個月(95%CI：20.31-22.24),1年總體生存率為71%；在Skp2陰性組,中位生存期為個21.71個月(95%CI：11.15-16.18),1年總體生存率為91%。生存分析顯示,Skp2高表達組與Skp2陰性組間差異具有統計學意義(P=0.035)。結論Skp2的高表達可能是鼻腔NK/T細胞淋巴瘤預后的不良因素。

Skp2； Ki-67； EB病毒編碼RNA(EBER)； 鼻型NK/T細胞淋巴瘤

鼻型NK/T細胞淋巴瘤(nasal type natural killer/T-cell lymphoma,NKTCL)是一種特殊類型的非霍奇金惡性淋巴瘤,其腫瘤組織常侵犯鼻腔和上呼吸道和消化道,預后較差［1-2］。鼻型NK/T細胞淋巴瘤在歐美國家罕見,而在亞洲、墨西哥及南美洲地區相對多見。據報道,其在亞洲的發病率占到非霍奇金惡性淋巴瘤的2.6%～10.7%,占鼻咽部腫瘤的40%～70%。這很可能與EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染的地理分布特點有關［3］。

鼻型NK/T細胞淋巴瘤的發病與EB病毒感染有密切的關系,與鼻咽癌和霍奇金淋巴瘤相似,其EB病毒表現出Ⅱ型潛伏感染的特征,EB病毒的致瘤機制至今仍未完全闡明。一些研究發現：EB病毒通過與泛素蛋白酶系統的相互作用來維持其潛伏感染,并且活化特定癌基因,使得泛素依賴性蛋白降解系統失效［3-4］。

S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)屬于F-box蛋白家族,由F-box序列、Linger序列及亮氨酸重復序列結構域(Leucinerich-repeat,LRR)組成。Skp2則可以特異性識別并降解SCF(skp-cullin-F-box蛋白)復合體磷酸化底物P27,介導泛素化降解,調控細胞周期［5］。Skp2同時也是一種與淋巴瘤發生有關的癌基因［6］。P27是關鍵的細胞素依賴性激酶抑制子,可以在G1/S檢查點阻斷細胞周期進展。先前報道指出,P27的下調與多種腫瘤的預后相關,包括結腸癌、乳腺癌和前列腺癌。

近期,一些研究指出某些EB病毒編碼的蛋白可以調節Skp2依賴性泛素化,并且破壞哺乳動物細胞中的P27蛋白。這一證據提示鼻型NK/T細胞淋巴瘤的EB病毒潛伏感染可能導致Skp2與P27蛋白表達的失衡,從而促進腫瘤進展。Ki-67是一種與核增殖相關的抗原,表達于細胞周期的生長期與合成期,在G0期(靜息期)不表達［7］。盡管在既往研究中Ki-67的標記指數從4%～22%不等,但它仍為一種可靠的細胞增殖標記物［8］。

關于Skp2在鼻型NK/T細胞淋巴瘤的表達,其與EB病毒編碼RNA(EBV encoded RNA,EBER)表達,以及腫瘤的預后相關性,目前尚不清楚。本次研究通過免疫組化的方法,探討鼻型NK/T細胞淋巴瘤組織中Skp2和EBER的相關性,并進一步研究聯合檢測Skp2和Ki-67對于預后的指導意義。

材料和方法

研究對象選取從2011年1月1日至2011年12月31日在復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院確診的、有完整臨床病例資料且腫瘤組織充分的95例(鼻型NK/T細胞淋巴瘤)納入研究。所有病例均經2名經驗豐富的病理醫生作出診斷。

免疫組化染色（Skp2、ki67） 活檢標本均經4%中性甲醛溶液固定,石蠟包埋。免疫組化染色依照Envision兩步法,石蠟標本經脫蠟,梯度乙醇脫水、血清孵育后,滴加相應一抗,50μL/片,室溫下孵育1 h,4℃放置過夜,室溫平衡15 min,0.05 mol/L PBS(p H7.6)洗滌5 min×3次,滴加兩步法檢測系統En VisionTM/HRP)于組織上,50μL/片,37℃1 h。用PBS沖洗切片。Skp2陰性對照采用PBS,陽性對照采用扁桃體組織。Skp2主要定位于胞核,少數定位于胞質。每例切片均在高倍鏡下計數陽性細胞。Skp2陽性細胞比率超過50%的病例被計入高表達組中,低于50%的計入低表達組中［9］。Ki-67陰性對照采用PBS,Ki-67定位于胞核,每例切片均在高倍鏡下計數陽性細胞。Ki-67陽性細胞比率超過50%的病例被計入高表達組中,低于50%的計入低表達組中。所有陽性細胞均經2名經驗豐富的病理醫生雙盲計數。

原位雜交檢測EBER標本脫蠟水化后,用25 μg/m L的蛋白酶K(Merck公司產品),37℃消化10 min,水洗,根據標本大小,每片滴加10～20μL雜交液,蠟膜覆蓋,橡膠水封邊,70℃變性8 min,37℃雜交過夜。在室溫下各洗脫10 min×2次,去除未雜交信號。設置雜交液中無標記探針為陰性對照。參照Dig-DNA標記和檢測試劑盒(Boehringer Mannheim公司,Cat.No.1093657)的方法檢測。2%的正常羊血清室溫封閉20 min后,用BufferⅠ1∶2 000稀釋的地高辛抗體37℃孵育30 min, BufferⅠ洗3次,每次5 min；BufferⅢ中浸泡5 min后,加BufferⅢ稀釋的NBT/BCIP顯色液30 m L,暗濕盒中顯色1～3 h,緩沖液Ⅳ終止反應,空氣晾干,4℃保存。

統計分析采用SPSS17.0軟件進行數據分析。單因素生存分析采用Kaplan Meier法評估生存可能性,采用Log-rank分析意義。相關分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

臨床病理學特征共有95例鼻型NK/T細胞淋巴瘤納入研究,其人口和年齡組成、腫瘤生長部位及臨床病理學特征如下：男性71例,女性24例,男女比例為2.9∶1；年齡為16～86歲(只有1例為20歲以下),平均(55±15.37)歲,其中67例腫瘤生長位于鼻腔,13例位于鼻咽處,11例位于咽喉部；共有76例患者感染EB病毒,感染率為80%。我們對所有的病例進行1年隨訪,失訪患者26例。所有95例患者均進行了HE、Skp2、Ki-67和EBER免疫組化染色(圖1),其中Skp2的陽性率為44%,Ki-67的陽性率為99%,確診時共有63例的血清LDH水平,其中53例為正常,10例升高。

單因素生存分析利用Kaplan Meier法分別對性別、年齡(≤60歲和＞60歲)、部位、Skp2的表達程度(高、低)、Ki-67的表達程度(高、低、陰性)、EB的感染(陽性、陰性)以及LDH(升高、正常)進行了生存分析。結果發現：與Skp2陰性組相比,Skp2的高表達提示預后不良(χ2=6.770,P=0.035),年齡＞60歲組的預后不良(χ2=5.076,P=0.025),均具有統計學意義,其余因素未發現有統計學意義(表1、圖2)。

Skp2與EBER的相關性分析我們對Skp2表達高低、EBER以及Ki-67進行了Spearman相關性分析。發現Skp2表達與Ki-67呈正相關(Pearson相關系數為0.290,P=0.011),而與EBER無顯著的相關(Pearson相關系數為0.115,P=0.264,表2)。

討 論

Skp2由Demetric于1995年通過熒光原位雜交法發現,它是一種核蛋白,也是細胞周期的關鍵調節因子。Skp2包括一個F盒、10個富含亮氨酸的重復序列及一個C末端的模體,是SCF(Skp1-Cullin-F-box,SCF)復合物的底物識別亞單位,能夠識別并降解P27,后者的下調與多種腫瘤的預后相關［10-13］。

細胞周期失控在腫瘤的發生中有一定的意義,而Skp2是介導泛素化降解,調控細胞周期的重要蛋白。之前的研究指出Skp2與一些惡性腫瘤的預后呈負相關,在這些腫瘤中,Skp2的表達程度是獨立預后因素。這些研究的主要對象是上皮性腫瘤,包括喉癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、泌尿道移行上皮癌以及一些軟組織肉瘤［14-18］。近些年來,研究者開始探討Skp2的表達與非霍奇金淋巴瘤,主要是彌漫大B細胞淋巴瘤及白血病的預后關系［19-21］。研究表明,Skp2的表達程度與淋巴瘤的進展和預后相關,在生長相對緩慢的淋巴瘤中,Skp2的表達低,而在浸潤性進展性淋巴瘤中,Skp2的表達則相對較高。在動物模型中,也發現Skp2轉基因小鼠表現出較高的腫瘤發生率,其存活時間降低。在本次實驗中,我們收集的患者皆為鼻型NK/T細胞淋巴瘤,結果顯示,Skp2高表達組患者的預后較Skp2陰性組患者的預后差,這一點與之前研究所指出的Skp2的表達與非霍奇金淋巴瘤進展相關的觀點一致,也為Skp2的高表達是結外NK/T細胞淋巴瘤的不良預后因素這一觀點提供了更有力的證明。之前的研究發現Skp2高表達組淋巴瘤患者的預后較Skp2低表達組淋巴瘤患者的預后差,在本次實驗中,我們并未發現這樣的差異,部分原因可能是因為Skp2低表達組患者的失訪率過高、隨訪時間有限所致。這一觀點有待于擴大樣本量,及臨床病例資料更完備的實驗進一步驗證。

EB病毒感染狀態與鼻型NK/T細胞淋巴瘤的發病有密切關系,本研究中,EB病毒的感染率達到79%。研究發現,EBV編碼蛋白促使依賴于Skp2的泛素化,降低P27的表達,還可介導細胞周期蛋白E2F1的表達［22］。E2F1在非霍奇金惡性淋巴瘤中表達,其可以下調Skp2的表達,與預后有一定的相關性［23］。在本研究中,Skp2的表達率為47%,經統計學分析,與EBER感染狀態無明顯相關性,與之前的研究有些出入［24］。造成這一現象的原因可能與隨訪資料的局限性及隨訪時間不夠長有關,EB病毒感染與Skp2在鼻型NK/T細胞淋巴瘤發生過程中相互作用的機制有待進一步闡明。

既往研究發現在胃腸道間質瘤及其他一些間質性腫瘤中,Skp2與Ki-67表現出強相關性［25-27］。本次實驗發現,鼻型NK/T細胞淋巴瘤Skp2與Ki-67的表達有相關性(P＜0.025)。在將來的研究中,可以在更龐大、更完整的淋巴瘤臨床病理資料中繼續查證Skp2表達與Ki-67及其他惡性細胞參數的相關性,以探索Skp2是否可作為評價腫瘤惡性程度及侵襲性的一種輔助指標。

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The expression and clinical significance of Skp2 in nasal type NK/T-cell lymphoma

XING Yue1,WANG Shu-Yi1△,XU Zu-De2
(1Department of Pathology,Eyes,Ears,Nose and Throat Hospital,Fudan University,Shanghai 200031,China；
2Department of Pathology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China)

Objective To discuss the correlation between Skp2 and the prognosis and other clinicopathological features of nasal type NK/T-cell lymphoma.MethodsWe collected the clinicopathological data of 95 cases of nasal type NK/T-cell lymphoma,detected the expression of EBV encoded RNA(EBER),Skp2 and Ki-67 of paraffin-embedded tissue of tumors using immunohistochemical method.The cases with the Skp2-positive rate of tumor cells above 50%were classified into high expression group,those with below 50%were classified into low expression group. We analyzed the correlation between the expression of Skp2 and Ki-67,and the prognosis or EBER status.ResultsIn the high expression group,the mean overall survival was 20.54 months(95%CI：18.49-22.59),the 1-year overall survival rate was 76%.In the low expression group,the mean overall survival was 17.54 months(95%CI：20.31-22.24),the 1-year overall survival rate was 71%.In the negative expression group,the mean overall survival was 21.71 months(95%CI：11.15-16.18),the 1-year overall survival rate was 91%.There was statistical difference between Skp2 high expression group and Skp2 negative expression group(P＜0.01).ConclusionsThe high expression of Skp2 maybe an independent unfavorable prognosis factor of nasal type NK/T-cell lymphoma.

Skp2； Ki-67； EBV encoded RNA(EBER)； nasal type NK/T-cell lymphoma

R 73

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.010

2013-03-29；編輯：張秀峰)

△Corresponding author E-mail：sywangsh@hotmail.com