負載輻射凋亡MB49腫瘤細胞抗原的樹突狀細胞（DC）疫苗對小鼠膀胱癌的抑制作用

謝雪鋒 侯劍剛陳 剛丁 強

(1復旦大學附屬金山醫院泌尿科 上海 201508；2復旦大學附屬華山醫院泌尿外科研究所 上海 200040)

負載輻射凋亡MB49腫瘤細胞抗原的樹突狀細胞（DC）疫苗對小鼠膀胱癌的抑制作用

謝雪鋒 侯劍剛2△陳 剛1丁 強2

(1復旦大學附屬金山醫院泌尿科 上海 201508；2復旦大學附屬華山醫院泌尿外科研究所 上海 200040)

目的研究輻射凋亡MB49腫瘤細胞誘導的樹突狀細胞(dendritic cell,DC)疫苗的制備及對C57BL/6小鼠體內膀胱腫瘤的免疫學效應。方法采用輻射法獲取MB49細胞抗原并用其致敏骨髓來源的DC來制備DC疫苗。用MB49小鼠膀胱癌細胞建立荷瘤動物模型,隨機分為實驗組和對照組,于腫瘤細胞接種后第7、14天給予相應DC疫苗治療或者PBS,每組分為2個亞組,分別用于測量瘤質量、體積及用于觀察荷瘤小鼠存活情況。結果

樹突狀細胞(DC)； 膀胱腫瘤； 疫苗； MB49細胞； 小鼠

樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是目前發現最強大的抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC),能有效激發T細胞應答并誘導特異性細胞

毒性T淋巴細胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)生成。在我國,膀胱腫瘤是泌尿系統最常見的惡性腫瘤,發病率居全身腫瘤的第5位,其中移行細胞癌占95%。利用DC疫苗接種宿主,誘導或增強宿主防御功能,提高機體免疫系統對腫瘤的特異殺傷能力,已成為晚期膀胱癌免疫治療中的研究熱點。

材料和方法

細胞培養MB49細胞來源于通過致癌物誘發C57BL/6雌性小鼠的膀胱移行細胞癌(復旦大學華山醫院泌尿外科研究所提供)。細胞培養液為10%胎牛血清、1%盤尼西林/鏈霉素及含0.1%丙酸鈉的RPMI-1640培養液。細胞在5%CO2、37℃培養箱中培養。

實驗動物采用C57BL/6雌性小鼠,4～6周齡,體質量17～20 g,飼養在SPF級動物房中。

骨髓來源DC的制備及鑒定DC細胞提取方法主要參照Inaba的方法。取6周齡健康雌性SPF級C57BL/6小鼠,處死后取脛骨和股骨,1 m L注射器抽取無菌預冷PBS沖洗骨髓腔；經200孔單細胞過濾鋼篩過濾,收集濾液,161×g離心5 min,棄上清；加40 g/L的Tris-NH4Cl溶液1 m L重懸細胞團,反應2 min,161×g離心5 min,去除裂解之紅細胞,棄上清,PBS洗滌2次,每次5 min。細胞團重懸于含體積分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中,使細胞密度達到1.5×106/m L轉移至6孔培養板內,每孔2 m L,培養24 h后,PBS洗滌2次,去除未貼壁細胞,換用含重組小鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子(10μg/L)和重組小鼠IL-4(5μg/L)的RPMI-1640完全培養液繼續培養。

采用流式細胞儀鑒定細胞。將收集的細胞(密度5×105/m L)置于含2μg單抗(CD11c-APC、CD11b-PE、CDI-A-PE、CD80-PE、CD46-PE)的BSA-PBS中,4℃孵育30 min,PBS洗滌2次,加FITC熒光標記的羊抗大鼠IgG,4℃孵育30 min, PBS洗滌2次,重懸于含1%多聚甲醛的PBS中,進行流式細胞儀(FACS Becton-Dickenson)檢測。

腫瘤細胞的照射和凋亡測定為了獲得凋亡的腫瘤細胞,我們收集了培養中的MB49細胞,制成密度為1×107/m L的單細胞懸液,然后用100 Gy X線照射(Faxitron CP-160)［1］。經過照射的細胞用不含胎牛血清的RPMI-1640培養,每天通過Annexin V-FITC和PI染色后利用流式細胞儀測定凋亡細胞的比例。

腫瘤細胞抗原的負載經過照射的MB49細胞用不含胎牛血清的RPMI-1640培養3天,以1∶1的比例和密度為1×106/mL的未成熟DC混合培養24 h于實驗組。對照組用LPS刺激的未成熟DC細胞。

DC疫苗的保護作用研究C57BL/6雌性小鼠40只,隨機分為4組,分別皮下注射PBS、未成熟DC細胞(im-DC)、LPS促熟的DC(LPS-DC)及經過照射含有凋亡MB49細胞共同培養的DC細胞(MB49-DC)。7天后再重復接種1次。第2次接種的7天后,皮下接種MB49腫瘤細胞。每組分為2個亞組,分別測量腫瘤體積,并觀察荷瘤小鼠的存活情況。

數據分析采用SPSS 10.0軟件。計量數據以x—±s表示,組間比較采用t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

通過體外培養可以獲得大量DC細胞骨髓來源的干細胞可以被誘導分化成具有免疫效應的DC。為了研究負載腫瘤抗原誘導的免疫反應,需要足夠量的處于同一成熟水平的DC細胞。我們首先在培養液中加入IL-4和GM-CSF,以體外擴增小鼠骨髓來源的干細胞(圖1)。擴增到第5天,檢測表面抗體顯示CD11c高表達,但是CD80、CD86及I-A低表達,提示為未成熟DC細胞。加入LPS共同培養后第7天,檢測CD80、CD86及I-A,提示為DC細胞成熟(圖2)。

X線照射后獲得凋亡的腫瘤細胞為了獲得最佳的凋亡細胞數,每天用流式細胞儀測定經過照射并用無血清培養液培養的腫瘤細胞,結果顯示在第3天細胞凋亡達到最佳數目(圖3)。

凋亡腫瘤細胞和未成熟DC細胞共培養獲得成熟DC細胞培養至第5天的未成熟DC和經照射及無血清培養的DC共培養1天后,流式細胞測定顯示成為成熟DC細胞(圖4)。

DC疫苗的保護作用為了檢測負載了特殊腫瘤抗原的DC細胞是否具有疫苗功能,我們進行了皮下腫瘤模型［1］的抑制實驗。單純注射PBS后,腫瘤生長速度快,且小鼠很快出現死亡；注射未成熟DC及LPS-DC后,腫瘤生長速度有所減慢,但最終也導致小鼠全部死亡(圖5)；注射MB49-DC后,腫瘤生長速度緩慢,且有2只小鼠出現無瘤存活(圖6)。

討 論

DC是目前所知功能最強的抗原提呈細胞,DC可在其分布位置上捕獲、加工抗原,遷移到淋巴器官中激活T淋巴細胞,尤其是初始T細胞(naive T cells)和靜息T細胞(resting T cells)。T淋巴細胞介導的細胞免疫特別是CTL在機體抗腫瘤和抗感染中起到重要作用［2］,利用負載相關抗原的DC作為疫苗進行腫瘤生物治療大有前景［3］。大量實驗證實,用不同形式的腫瘤抗原體外沖擊致敏DC后,可以產生較強的抗腫瘤免疫,并能抑制腫瘤生長和轉移,目前一些體內和臨床試驗仍在進行中［4-5］。在對腫瘤疫苗的探索中,研究人員采用多種策略研制DC瘤苗,以激發抗腫瘤特異性免疫應答,主要包括負載腫瘤抗原的DC、腫瘤抗原致敏的DC和腫瘤抗原基因轉染的DC等［6］。用腫瘤細胞裂解物致敏的DC疫苗能誘導有效的CTL反應,裂解腫瘤細胞,并能分泌高水平的干擾素γ(interferon,IFN)［7］。然而,細胞性抗原因含有多種非腫瘤相關抗原且抗原性差。而全細胞性抗原具有多種抗原表位,可誘導針對不同抗原決定簇的CTL克隆,更有利于對腫瘤細胞的免疫攻擊。Fry等［8］研究表明,相對于其他方法,腫瘤細胞經過照射后導致細胞凋亡,并與未成熟DC共同培養,未成熟DC可以吞噬凋亡體,并攝取、加工和提呈腫瘤抗原,從而能極大地提高DC的抗腫瘤活性。Hoffmann等［9］認為,使用凋亡細胞比使用裂解物對產生自體CD8+CTL更有效。

我們的研究提示,通過體外培養可以獲得大量高質量的DC,為DC治療提供了可能性。但是未成熟DC不具有疫苗作用而達不到治療效果。利用LPS誘導的成熟DC因為沒有呈遞腫瘤抗原,同樣沒有疫苗作用。

經過射線照射后的腫瘤細胞可以檢測到大量凋亡細胞。一方面,射線利用其穿透力,使腫瘤細胞內部發生電離效應,破壞其DNA結構,抑制或殺死腫瘤細胞；另一方面,射線通過誘導腫瘤細胞釋放HMGB-1、HSP70等內源性“危險信號”而提高腫瘤細胞的免疫原性,同時會上調MHC-1和ICAM-1、VCAM-1等黏附分子的表達,進而趨化免疫細胞,并激活宿主固有免疫應答甚至適應性免疫應答。凋亡的腫瘤細胞可作為抗原信號誘導特異性免疫反應。另外,DC吞噬凋亡細胞后出現成熟反應,上調趨化因子、細胞因子和共刺激分子。Albert等［10］認為,DC與凋亡細胞共孵育可產生腫瘤特異性CTL,而壞死細胞不可以。

我們的實驗提示,經射線照射后腫瘤細胞中可檢測到大量調亡細胞,其與未成熟DC共孵育后,可以產生高純度的成熟DC,利用調亡的腫瘤細胞誘導的成熟DC具有疫苗作用。本研究表明,負載輻射凋亡腫瘤細胞的DC疫苗對C57BL/6小鼠膀胱腫瘤具有腫瘤抑制效應,并能延長小鼠生存期。

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Inhibitory effects of dendritic cell（DC）vaccine loading antigen with irradiated apoptotic MB49 tumor cells against bladder cancer cells in mice

XIE Xue-feng1,HOU Jian-gang2△,CHEN Gang1,DING Qiang2
(1Department of Urology,Jinshan Hospital,Fudan University,Shanghai 201508,China；
2Institute of Urology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China)

Objective To investigate the effects of dendritic cell(DC)vaccine sensitized by antigen with irradiated apoptotic MB49 tumor cells on the treatment of bladder cancer in mice.MethodsMB49 antigen was obtained by irradiation and then sensitized bone marrow derived DC(BM-DC)to establish DC vaccine. Mice bearing bladder cancer were divided into DC group and control group.On the 7thand 14thday after subcutaneous of tumor cell,DC group was injected DC vaccine,and the control group was injected PBS.Each group was divided into two subgroups in order to measure tumor mass and volume and to observe survival condition of mice.ResultsThe average mass and volume of tumors in mice of DC group were significantly higher than those of the control group(P＜0.01),which also had longer survival period.Two mice in DC group survived without tumor for 30 days.Although they were injected MB49 cells for the second time,there was no tumor growth in 30 days.ConclusionsDC vaccine loading antigen with irradiated apoptotic MB49 tumor cells can inhibit the growth of MB49 cells in vivo.

dendritic cell(DC)； bladder tumor； vaccine； MB49 cells； mice

R 737.14

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.014

2013-03-28；編輯：王蔚)

△Corresponding author E-mail：hou_jiangang@hotmail.com

負載輻射凋亡腫瘤細胞DC疫苗的實驗組荷瘤小鼠,其腫瘤的平均體積和平均質量均顯著低于對照組(P＜0.01),生存期長于對照組。DC疫苗實驗組中有2只小鼠30天內無腫瘤生長,再次皮下接種MB49細胞觀察30天仍無腫瘤發生。結論負載輻射凋亡腫瘤細胞的DC疫苗對膀胱腫瘤荷瘤小鼠具有抑瘤效應和延長生存期的作用。