芳香烴受體（AhR）在乳腺癌中的表達及其與阿霉素化療耐藥的相關性

李正東楊新偉成小林莊志剛童曉文

(1同濟大學附屬第一婦嬰保健院乳腺外科 上海 200040；2上海中醫藥大學附屬市中醫醫院中醫外科 上海 200071；3同濟大學附屬同濟醫院婦產科 上海 200065)

芳香烴受體（AhR）在乳腺癌中的表達及其與阿霉素化療耐藥的相關性

李正東1楊新偉2成小林1莊志剛1童曉文3△

(1同濟大學附屬第一婦嬰保健院乳腺外科 上海 200040；2上海中醫藥大學附屬市中醫醫院中醫外科 上海 200071；3同濟大學附屬同濟醫院婦產科 上海 200065)

目的觀察芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,Ah R)在乳腺癌組織中的表達,并探討乳腺癌細胞AhR表達與阿霉素化療耐藥的關系。方法應用免疫組化染色法觀察AhR在50例乳腺癌標本中的表達,其中淋巴結轉移癌40例,正常乳腺組織10例。采用Ah R-siRNA表達載體和脂質體法瞬時轉染基因沉默Ah R高表達的乳腺癌細胞株MCF-7/ADR；RT-PCR和Western bolt法檢測轉染后Ah R mRNA及蛋白的表達；MTT法檢測細胞增殖活性及轉染前后乳腺癌細胞對阿霉素敏感性的變化。結果Ah R在乳腺癌組織表達率為82.0% (46/50)、在乳腺癌轉移淋巴結中表達率為92.5%(37/40),而在正常乳腺組織中10%(1/10)有表達。乳腺癌及乳腺癌轉移淋巴結中AhR的表達均顯著高于正常乳腺組織(P＜0.05)。基因沉默AhR高表達的乳腺癌細胞株MCF-7/ADR后24 h,PCR和免疫印跡結果均顯示乳腺癌細胞株Ah R基因及蛋白表達水平降低。MTT顯示AhR基因沉默對乳腺癌MCF-7/ADR細胞的增殖活性有顯著的抑制作用,48 h細胞增殖抑制率可達52%。Ah R沉默后乳腺癌細胞對阿霉素的半數有效濃度(IC50)由(18.2±0.9)μmol/L降低至(8.4±1.1)μmol/L (P＜0.05)。結論siAhR能夠有效抑制AhR基因的表達,降低乳腺癌細胞的增殖能力。AhR對阿霉素耐藥過程發揮作用,沉默Ah R表達能一定程度上逆轉阿霉素耐藥現象。

乳腺癌； RNA干擾； 化療耐藥； 阿霉素

目前乳腺癌的主要治療方法是手術結合化療的綜合治療,而乳腺癌細胞在化療中產生的多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)是導致化療失敗的主要原因之一［1］。由于阿霉素類化療藥物在乳腺癌輔助化療及復發轉移后的解救治療中被廣泛應用,因此研究阿霉素化療耐藥的逆轉具有重要意義。

芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)作為一種廣泛分布于人體多個器官的配體誘導性轉錄因子,參與多種生物學功能的調節且與多種腫瘤的發生密切相關。文獻報道Ah R在前列腺癌、肝癌、卵巢癌中均有高表達［2-4］。本研究觀察AhR在乳腺癌組織中的表達情況,并采用AhR高表達的乳腺癌細胞株MCF-7/ADR,通過瞬時轉染siRNA基因,探討Ah R表達與乳腺癌阿霉素化療耐藥的關系,為臨床阿霉素類化療耐藥個體提供治療依據。

資料和方法

材料和試劑50例乳腺癌石蠟標本,其中非特殊性浸潤性導管癌46例,神經內分泌癌1例,髓樣癌3例。乳腺淋巴結轉移癌40例,正常乳腺組織10例。組織芯片購自陜西超英生物公司(BR1008)；MCF-7/ADR細胞由復旦大學附屬腫瘤醫院乳腺癌研究所提供,常規培養傳代；Ah R引物

序列由上海生工合成。DMEM培養基、胎牛血清、阿霉素(美國Gibico公司),DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術有限公司),Ah R抗體(美國Invitrogen公司),脂質體2000、Ah R-siRNA(美國Santa Cruz公司),MTT(美國Promege公司),RTPCR試劑盒(美國MBI公司),兔抗人Ah R單克隆抗體及SP試劑盒(美國Biomol公司)。

免疫組化染色切片常規HE染色,采用鏈霉素親和素一過氧化酶復合物法(SP法)行Ah R免疫組化染色,Ah R一抗按1∶500稀釋,實驗程序嚴格按即用型Max VisionTM試劑盒說明書進行。以腫瘤細胞胞質內出現棕黃色染色為Ah R陽性,在顯微鏡下采集5個不重疊的高倍視野(×400),用數字顯微攝影系統拍照,由2位病理科醫師分別評估。Ah R評估采用Remmele等提出的免疫反應評分(immume response scores,IRS),依據免疫組化染色范圍記分為0～4(0～4個視野),染色深度記分為0～3(弱、中、強),因此染色總評分為0～12。

構建載體及細胞轉染參照siRNA設計原則,結合AhR基因序列特征,設計siAhR序列。引物1：3ˊ-ATCAAGCGCTCGGGGCACCATGAACA-5ˊ,引物2：3ˊ-CCCATGGCAGCTGACGCCGAGATCTGGA-5ˊ。Ah R-siRNA組：轉染si Ah R,特異性干擾目的基因AhR表達；空脂質體對照組：轉染siNC,對AhR無沉默作用。將Ah R siRNA組和空脂質體組進行細胞轉染處理。常規培養MCF-7/ADR細胞,使細胞密度達80%。用無血清雙抗培養液稀釋脂質體2000和siRNA至所需濃度,室溫靜置5 min,混勻,室溫靜置20 min,形成穩定的siRNA-脂質體混合物。將待轉細胞加入上述混合物,6 h后更換培養液繼續培養。

RT-pCR檢測Ah R-siRNA表達轉染后24 h收集兩組細胞,參照Trizol說明書,提取細胞總RNA進行逆轉錄反應。建立PCR反應體系,以GAPDH為內參,對RT-PCR目的基因Ah R進行擴增,擴增產物為368 bp。擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳,觀察各條帶吸光度(D)值,用Ah R/GAPDH灰度值表示AhR mRNA相對含量。

Westernblot檢測AhR蛋白表達將細胞低密度鋪于6孔板,24 h后用快速制備法提取核蛋白,經電泳、轉膜后雜交,一抗為兔抗人Ah R單抗,二抗為鼠抗兔多抗,以NBT/BCIP顯色。采用圖像處理儀分析處理,測定D值并計算其與空白對照組的比值。

MTT法檢測細胞增殖按上述為法處理細胞,處理后24、48、72和96 h分別收集細胞,行MTT染色,酶標儀下570 nm波長處測定D值,計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率(%)=(空白組D值-處理組D值)/空白組D值×100%。

MTT法檢測耐藥逆轉效果轉染后48 h收集細胞,細胞濃度整至1×105/m L,取單細胞懸液100 μL,加入終濃度為0.1、1、10、100μmol/L的阿霉素,常規MTT法檢測試驗細胞和耐藥細胞的生存率,每個濃度梯度均設對照組和空白調零孔。在酶標儀上以570 nm和630 nm雙波長檢測D值。終D值=D570-D630,TCL=加藥組D值/對照組D值×100%。實驗重復3遍,取平均值,采用Graphpad Prism軟件計算IC50。

統計學處理統計學分析采用SPSS 13.0軟件,計量資料用x—±s表示,兩組間比較采用t檢驗。采用雙側檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

AhR在乳腺癌、乳腺癌轉移淋巴結及正常乳腺組織中的表達應用免疫組化方法發現,Ah R在82.0%的乳腺癌組織(46/50)、92.5%的乳腺癌轉移淋巴結(37/40)及10%的正常乳腺組織(1/10)中均有表達。免疫組化陽性染色主要表達于腫瘤細胞的胞質,乳腺癌組織中的表達陽性率及表達水平均高于癌旁正常乳腺組織。采用IRS評估Ah R免疫組化,乳腺癌組及乳腺癌轉移淋巴結組的評分均明顯高于乳腺癌勞正常組織(P＜0.05)。而乳腺癌組與乳腺癌轉移淋巴結組之間的評分無統計學差異(P＞0.05,圖1)。

siRNA轉染后細胞的AhRmRNA表達空載體組和siRNA組細胞在452 bp處均擴增出GAPDH條帶,掃描D值在24 h時基本相同。轉染24 h后siAhR組在368 bp處可見淺擴增條帶,而對照組在相應部位可見特異性條帶(圖2)。轉染24 h后,siAhR組的Ah R mRNA相對表達量明顯低于陰性對照組,說明siRNA成功干擾目的基因AhR的mRNA表達。

AhR-siRNA表達質粒對AhR蛋白表達的影響MCF-7/ADM乳腺癌細胞轉染siAh R后24 h,Ah R蛋白水平顯著低于對照組,表明轉染后MCF-7/ ADR的AhR基因表達受到抑制(圖3)。

轉染siAhR后對乳腺癌細胞增殖活性的影響由細胞生長曲線可見,si Ah R轉染乳腺癌細胞MCF-7/ADR后細胞增殖活性明顯受到抑制(P＜0.05),48 h抑制率可達52%(圖4)。

轉染前后乳腺癌細胞對阿霉素敏感性的變化siAhR組、空脂質體對照組阿霉素IC50值分別為(8.4±1.1)和(18.2±0.9)μmol/L。siAh R組明顯低于對照組(P＜0.01),結果提示AhR表達水平下調后,乳腺癌細胞MCF-7/ADR部分恢復了對阿霉素的敏感性,阿霉素耐藥性得到逆轉(圖5)。

討 論

化療藥物的原發或繼發耐藥是導致乳腺癌患者臨床化療失敗的主要原因之一。阿霉素類藥物是目前臨床上治療乳腺癌最常用的藥物,其在乳腺癌術后輔助化療、新輔助化療及復發轉移的解救化療中均發揮著重要作用［5］,因此研究乳腺癌的阿霉素類藥物耐藥具有明確的臨床意義［6］。阿霉素耐藥機制多樣,目前仍不能確定。現認為腫瘤最常見的耐藥機制是多藥耐藥糖蛋白介導的MDR［7］,因此多藥耐藥糖蛋白數量的增多也是化療失敗的原因之一。對于乳腺癌化療耐藥,可以通過逆轉MDR來提高化療藥物的敏感性［8］。

Ah R作為腫瘤相關蛋白和生物治療靶點越來越受到重視［9］。Ah R與多種細胞增殖活性、細胞周期及腫瘤的生長方式、侵襲等生物學行為密切相關,進而有可能影響化療效果［10］。對AhR基因敲除鼠模型的研究顯示,Ah R可影響生物的生殖、生存和生長,而細胞培養發現通過外源性Ah R配體激活及干擾會影響細胞黏附及基質代謝相關蛋白的表達(如基質金屬蛋白酶)［11］。這些研究結果都支持AhR可能通過影響細胞間黏附、基質代謝而調整細胞行為及信號反應。而細胞外黏附、基質降解和基底膜破壞是腫瘤細胞侵襲和轉移過程中的重要環節。盡管Ah R在實體瘤中的研究已經逐步開展,但是Ah R在人類乳腺癌發生、發展過程中的功能仍不清楚。Ah R不僅在人類乳腺癌組織中高表達,動物實驗也表明乳腺不同發育時期的Ah R配體TCDD暴露決定了患乳腺癌的危險性［12］。這些現象均表明Ah R在乳腺癌進展過程中發揮一定的作用。此外,Ah R與雌激素受體(estrogen receptor,ER)之間存在抑制性交互應答(inhibitory Ah R-ER crosstalk),從而發揮抗雌激素效應［13］。其機制可能為Ah R被外源性配體激活后發生Ah R-ER相互作用,引起ERα降解,進而抑制雌激素誘導的c-fos轉錄,并引起編碼組織蛋白酶D(cathepsin D)、p27和BRCA1等相關基因的轉錄下調［14］。

我們通過組織芯片觀察到,在乳腺癌組織及乳腺癌轉移淋巴結中Ah R表達明顯高于正常乳腺組織,而在乳腺癌與乳腺轉移淋巴結之間未見明顯差異。本研究未觀察到Ah R與乳腺癌轉移的關系,下一步將通過擴展樣本量及分層分析,以期在臨床病理方面有所發現。經基因及蛋白檢測證實乳腺癌細胞MCF-7/ADM中Ah R呈高表達。通過siRNA特異性抑制Ah R基因,MCF-7/ADM的細胞增殖受到抑制,其對阿霉素的反應性明顯增強,耐藥性在一定程度上得到逆轉。本實驗說明Ah R在乳腺癌細胞阿霉素耐藥方面存在一定作用,推測機制除了與Ah R對乳腺癌細胞增殖的抑制作用有關以外,還可能與MDR等對抗阿霉素藥物誘導的細胞凋亡相關。曾有報道在小鼠肝癌模型中Ah R與P53介導的多藥耐藥基因MDR1相關。本實驗還證實siRNA抑制Ah R基因表達的可行性,為進一步開展將AhR作為乳腺癌阿霉素增敏新靶點的研究提供了一定的實驗基礎。

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Aryl hydrocarbon receptor（AhR）expression in breast cancer tissues and its association with adriamycin chemotherapy resistance

LI Zheng-dong1,YANG Xin-wei2,CHENG Xiao-lin1,ZHUANG Zhi-gang1,TONG Xiao-wen3△
(1Department of Breast Surgery,First Maternal and Infant Healthcare Hospital,Tongji University,Shanghai 200040,China；2Department of Surgery of TCM,Municipal Hospital of Shanghai Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200071,China；3Department of Gynaecology and Obstetrics,Tongji Hospital,Tongji University,Shanghai 200065,China)

Objective To investigate both the expression of aryl hydrocarbon receptor(Ah R)in breast cancer tissues and its association with adriamycin chemotherapy resistance.MethodsAh R expression was observed by immunohistochemical staining in 50 specimens of breast cancer containing 40 cases of metastasis lymph nodes and 10 cases of normal breast tissues.Breast cancer cell line MCF-7/ADR with Ah R high expression was transfected by the Ah R-siRNA liposome vector.The expression of Ah R mRNA and protein was detected by RT-PCR and Western blot after transfection.Adriamycin sensitivity of breast cancer cells before and after transfection was determined by proliferation test,MTT.ResultsAh R in immunohistochemical staining was expressed in 82%(46/ 50)breast cancer tissue,in 92.5%(37/40)metastasis lymph nodes,and in 10%(1/10)normal breast tissue.AhR expression in normal breast tissues was significantly lower than that in breast cancers and metastasis lymph nodes(P＜0.05).PCR and Western blot results showed that expression of AhR gene and protein in breast cancer cell line MCF-7/ADR was decreased 24 hours later after Ah R gene silencied by liposome transfection.The proliferation of breast cancer cell MCF-7/ADR was significantly inhibited after Ah R gene was silenced.MTT showed the inhibition rate of cell proliferation was up to 52%at 48 hours.Median effective concentration(IC50)to adriamycin was decreased from(18.2±0.9) μmol/L to(8.4±1.1)μmol/L(P＜0.05)before and after AhR-silenced in breast cancer cells.ConclusionsAhR-siRNA can effectively inhibit the expression of AhR gene and reduce the proliferation of breast cancer cell.Ah R plays a role in adriamycin resistant process,so that Ah R silencing can partly reverse adriamycin resistant in breast cancer.

breast cancer； RNA interference； chemotherapy resistance； adriamycin

R 735.9

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.015

2013-08-27；編輯：王蔚)

上海市科委資助課題(134119a7900)

△Corresponding author E-mail：xiaowen_tong@yahoo.com

*This work was supported by Shanghai Municipal Science and Technology Commission Foundation(134119a7900).