小鼠Bin1b真核表達載體pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b構建及在真核細胞HEK293中的表達*

周 波 孫中義靳風爍 李彥鋒 張 軍 張克勤第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所泌尿外科（重慶 400042）

·論 著·

小鼠Bin1b真核表達載體pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b構建及在真核細胞HEK293中的表達*

周 波 孫中義**靳風爍 李彥鋒 張 軍 張克勤
第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所泌尿外科（重慶 400042）

目的構建表達小鼠抗菌肽蛋白（Bin1b）的真核表達載體pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b，對其在HEK293細胞中的表達進行檢測分析。方法應用PCR方法獲得Bin1b的cDNA片斷，將其插入pSG.SS.C3d3.YL中，經酶切鑒定正確后轉染HEK293細胞，利用間接免疫熒光結合激光共聚焦技術、Western blot技術、免疫組織化學染色技術及流式細胞儀檢測技術對Bin1b的表達進行檢測。結果構建成功后的pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b在HEK293細胞中能夠表達Bin1b。 結論 Bin1b在真核細胞中的成功表達為后續研究Bin1b的高表達對受精過程的影響奠定了基礎。

真核細胞; 遺傳載體; 基因表達; 熒光抗體技術, 間接

附睪對精子成熟、儲存和保護的作用因具有以下兩個最重要的特點而早已經被認同，并被視為進行抗生育的一個理想的靶器官[1,2]。這兩個特點一是功能較為單一，干擾功能的藥物不致引起嚴重的副作用。二是精子在進入附睪前已經分化完全，基因轉錄已經停止，其成熟功能的獲得一般與蛋白質修飾有關，不涉及DNA復制機能，因此干擾藥物不會引起DNA改變的遺傳病?？咕牡鞍祝˙in1b，或SPAG11）自附睪頭部中段的上皮細胞中分泌入管腔后與還沒有運動能力的精子結合，通過L型鈣離子通道使精子攝取鈣離子，“起始”精子運動[3,4]。因此，Bin1b極有可能成為免疫節育疫苗的理想靶抗原。上個世紀90年代后期發現2或3個串聯的補體C3裂解片段C3d具有強烈的免疫佐劑效應，可大大提高抗原的免疫原性[5]。因此本研究利用了補體領域的這一重要發現，以Bin1b作為研究目標，引入C3d作為分子內佐劑，制備含有Bin1b和串聯的3個C3d（C3d3）融合基因的真核重組表達載體pSG.SS.C3d3. YL-Bin1b，并對其在真核細胞中的表達進行鑒定。

材料與方法

一、菌種、質粒和試劑

大腸桿菌DH5α為本室保存菌種、含Bin1b基因編碼序列的重組載體pYA3149-Bin1b由李彥鋒博士惠贈，空載體pSG.SS.YL和pSG.SS.C3d3.YL由梁培禾博士惠贈。HEK293細胞和Raji細胞購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。分子生物學操作所用工具酶購自日本TaKaRa公司，質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒購自美國Omega公司，胰蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxford公司，瓊脂粉、瓊脂糖等購自上海生工生物技術服務有限公司，DMEM購自美國Gibco公司，引物由上海鼎安生物科技有限公司合成，脂質體轉染劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。抗Bin1b羊抗多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司（SPAG11A/ B， K-13，sc-103236），SP9000免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，FITC標記的兔抗羊IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。

二、方法

（一）引物設計

根據Bin1b 結構將引物設計為：Forward primer：TGCACAGAGAGCGAGCCGTA，Reverse primer：ATGCACCGTCAGCCACACAT，所對應的堿基為第35至第370bp，目的條帶為336bp。在以上引物前端分別添加限制性內切酶BglⅡ（AGATCT）和BamHⅠ識別序列（GGATCC），并添加保護性堿基各2個（GA和CG），得以下結果：Forward primer：5’-GAAGA TCTTGCACAGAGAGCGAGCCGTA-3’ （插入BglⅡ酶切位點）；Reverse primer：5’-CGGGATCCATGC ACCGTCAGCCACACAT-3’ （插入BamHⅠ酶切位點）；如此所得的目的條帶為336+6+2+6+2=352 bp。

（二）Bin1b基因擴增和重組載體pSG.SS.C3d3. YL-Bin1b的構建

以pYA3149-Bin1b為模板進行PCR反應（94℃30s，55℃ 30s，72℃ 60s共30個循環）獲得352bp大小的目的片段。BglⅡ分別酶切PCR產物和pSG. SS.C3d3.YL，用PCR產物純化試劑盒進行回收，對回收產物分別用BamHⅠ進行再酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳酶切產物后，紫外燈下分別切割含目的片段和載體的凝膠，膠回收試劑盒進行回收。T4 DNA連接酶連接膠回收產物（16℃，1h）并轉化連接產物至DH5α，挑取單菌落進行質粒擴增。用BglⅡ和BamHⅠ雙酶切鑒定正確后的重組質粒命名為pSG. SS.C3d3.YL-Bin1b。

（三）pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b轉染HEK293細胞

按2×105細胞/孔接種人胚腎HEK293細胞至鋪有蓋玻片的六孔板中，待細胞長至90%融合時以空載體pSG.SS.C3d3.YL為對照進行轉染。具體方法為：（1）將10μg DNA用250μL無抗無血清DMEM稀釋并混勻后，室溫孵育5min；（2）用240μL無抗無血清DMEM稀釋10μL Lipofectamine 2 000并混勻后，室溫孵育5min；（3）將以上（1）和（2）中混合液進行混和即成轉染混合液，室溫孵育15min；（4）將六孔板中培養液換用1mL無抗無血清DMEM，加入轉染混合液，并輕柔混勻，置于CO2培養箱中（37℃，5%CO2）孵育；（5）4h后，棄去培養液，換用含10%小牛血清之DMEM繼續培養。

（四）Bin1b表達的間接免疫熒光檢測

轉染完成48h后，取出蓋玻片，冰丙酮固定5min，根據SP9000試劑盒進行酶修復與抗原封閉，加入Bin1b抗體（1:400），孵育40min，PBS洗去抗體，加入FITC標記的抗羊IgG（1:500稀釋）室溫孵育30min，熒光顯微鏡觀察結果。

（五）Western blot 鑒定

收集轉染細胞培養上清，離心后裝入透析袋，置于PEG6000固體中，將上清液濃縮50倍，利用紫外分光光度法進行蛋白定量，并用上樣緩沖液稀釋至2500μg/mL后進行SDS-PAGE電泳。首先灌制聚丙烯凝膠，灌藥時先灌下層的分離膠，再灌上層的濃縮膠，然后再上樣（每孔50ug/20μL）進行蛋白電泳（電壓濃縮膠為90V，分離膠為140V）。電泳結束后，進行PVDF膜電轉，100V恒壓電轉1h，移入4℃冰箱20V電轉過夜。取出PVDF 膜，放入加有封閉液的密封塑料袋中，室溫搖動4 h。洗膜后加入Bin1b抗體（1:400），室溫搖動1h，加入二抗（HRP標記抗羊IgG，1:1000稀釋），室溫搖動1h，洗膜后顯影；將PVDF 膜置于NEN化學發光試劑中反應1～3min；在暗室中使X 光片曝光，常規方法顯影和定影。

（六）免疫細胞化學染色鑒定

蓋玻片多聚賴氨酸包被后置于6孔細胞培養板中，然后將處于對數生長期的HEK293細胞接種于其中，同前進行質粒轉染；轉染后繼續培養過程中，細胞爬附于蓋玻片上。 冷丙酮固定5～10min，0.3% H2O2甲醇溶液（新鮮配制）室溫浸泡30min。5ml/L Triton-X 100 在4℃條件下通透細胞膜2min。 正常山羊血清室溫下封閉20min，甩去多余液體。 滴加一抗（1:500），室溫孵育40min，滴加二抗（HRP標記抗羊IgG，1:400稀釋），37℃孵育0.5 h。DAB顯色。蘇木素復染10s，鹽酸酒精分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，以胞漿內出現明確棕黃色顆粒判定為陽性，照相記錄。

（七）流式細胞儀鑒定

Raji 細胞膜上具有豐富的 CD21分子（C3d 受體），把其與不同表達產物共孵育，間接免疫熒光染色標記Bin1b抗原，只有當Bin1b與C3d3為融合蛋白時，才能使Raji 細胞熒光標記為陽性，利用流式細胞儀測定陽性細胞比例。具體方法如下：獲取不同質粒轉染細胞培養上清，各取150μL與Raji細胞37℃孵育1h。PBS漂洗后滴加一抗，500μL重懸細胞，室溫孵育45min。 PBS漂洗后滴加二抗（FITC標記抗羊IgG，1:200稀釋）重懸細胞，室溫孵育45min。PBS重懸細胞后進行流式細胞儀檢測。

結 果

一、PCR法獲得Bin1b基因

利用PCR法，成功獲取了約352bp的目的片段，酶切后結果見圖1。

二、重組載體pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b的鑒定

為鑒定構建的重組載體是否正確，對提取后的質粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b用BglⅡ和BamHⅠ雙酶切進行鑒定。0.8%瓊脂糖凝膠電泳酶切結果（圖2）顯示，近352bp處的條帶為酶切后的目的片段，測序結果也顯示該片段為Bin1b編碼基因，表明pSG. SS.C3d3.YL-Bin1b構建成功。

三、重組載體pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b表達檢測

以pSG.SS.C3d3.YL空載體的免疫熒光結果為陰性相比，pSG.SS.YL-Bin1b和pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b的表達結果顯示大量目的蛋白表達于胞漿和胞核中，表明真核細胞中Bin1b 表達成功，見圖3。

四、Western blot檢測結果

質粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b及pSG.SS.YL-Bin1b轉染HEK293細胞后，Western blot檢測顯示細胞培養上清中存在分子量分別為116kD及6 kD分子量的表達產物，與Bin1b-C3d3融合蛋白及Bin1b蛋白理論分子量（5.8KD）接近；質粒pSG.SS.YL轉染后無可與抗Bin1b抗體結合的蛋白產物表達，見圖4。

圖1 Bin1b PCR產物經BglⅡ和BamHⅠ酶切電泳結果

圖2 pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b和pSG.SS.YL-Bin1b酶切鑒定電泳結果

圖3 不同Bin1b重組載體蛋白表達熒光檢測結果

圖4 不同重組質粒轉染HEK293細胞后培養上清中表達產物的Western blot分析

五、免疫細胞化學染色結果

重組質粒轉染HEK293細胞后，免疫細胞化學染色檢測Bin1b表達，pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b為強陽性，pSG.SS.YL-Bin1b為陽性，見圖5。

六、流式細胞儀檢測結果

重組質粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b、pSG.SS.YLBin1b及pSG.SS.YL轉染HEK293細胞后，用流式細胞儀檢測與不同培養上清共孵育后的Raji細胞表面Bin1b抗原存在情況，顯示前者熒光標記陽性細胞比例高達89.2%，而后兩者僅為8.5%和3.5%（圖6），說明重組質?？杀磉_融合蛋白，且其中Bin1b可被相應抗體識別，而C3d與其受體結合的功能也未受到影響。

討 論

圖5 轉染HEK293細胞后Bin1b免疫細胞化學分析 ×200

圖6 Raji細胞表面 Bin1b抗原流式細胞儀檢測結果

目前雖然國內外已有多種方式用于控制生育，但仍缺乏能為兩性所普遍接受的理想避孕措施，因而開發新的安全、高效、方便、廉價、可逆的避孕方法仍是當前生殖與避孕研究領域的焦點問題之一。目前世界上所采用的避孕措施主要以女性為主，有關避孕藥物還不完善，有致畸、肝臟毒性等副作用，其遺傳后果還有待進一步評估。男性主動參與避孕將很好促進男女平等和社會進步[6]，目前可供男性選擇的避孕措施中雄性免疫避孕疫苗更具有重要意義[7]。

睪丸和附睪受到生理屏障保護，機體的免疫系統不識別自身的睪丸和附睪蛋白。當這些蛋白進入血液中，機體的免疫系統就因為從來都不認識這種物質而把它們當成外來入侵者，從而產生抗體以消滅和阻截它們。Bin1b自附睪頭部中段的上皮細胞中分泌入管腔后與還沒有運動能力的精子結合，通過L型鈣離子通道使精子攝取鈣離子，“起始”精子運動。張永蓮院士將附睪頭部未成熟的精子和附睪頭部上皮細胞（含Bin1b）或轉染了Bin1b的小腸上皮細胞共培養，發現能夠促進精子的運動，但加入Bin1b的抗體后則無此效果；他們還在從附睪尾部取得的成熟精子中加入Bin1b的抗體，結果顯示精子的活動能力受影響不大。說明Bin1b能啟動未成熟精子的運動能力，但對維持成熟精子的活動不起主要作用[8]。研究還排除了附睪頭部其他分泌因子參與未成熟精子前向運動能力的獲得，將Bin1b的cDNA轉染到結腸上皮細胞系T84，構建穩定表達Bin1b的Bin-T84細胞系和空載體轉染的對照組Vet-T84細胞系，然后同樣將兩者與不游動的未成熟精子共培養。可以發現在精子運動力增加、前向運動百分比增加和這些時相分布上，Bin-T84細胞與精子共培養和附睪頭部細胞與精子共培養相似，相對照的Vet-T84細胞精子共培養則沒有顯著增加。因此Bin1b參與了精子成熟中未成熟精子開始獲得前向力這一關鍵點[8]。

C3d 與B 細胞和濾泡樹突狀細胞（FDC）上的受體（CR2 ,CD21）的相互作用對于正常體液免疫應答的誘導和維持至關重要。自從1996 年Thornton 等[9]報道C3d 是一個能顯著增強體液免疫效力的分子佐劑以來，此后許多研究相繼證實C3d 是具有巨大潛能的疫苗佐劑。分子佐劑C3d 通過與抗原分子的偶聯，能夠提高抗原的免疫原性，降低B 細胞的活化閾值，增強免疫應答的強度[10]。

基于目前的研究現狀，本實驗中我們構建了能夠在真核細胞中表達的重組載體pSG.SS.C3d3.YLBin1b，結果證實構建成功。正確的堿基序列是DNA疫苗接種后能正確表達并發揮作用的關鍵，對轉錄、翻譯后修飾等方面更具有重要意義。因此，應對表達產物加以分析驗證，Western blot結果顯示可見有116kD的條帶，符合Bin1b-C3d3融合蛋白的理論分子量值。用抗Bin1b的抗體進行免疫組織化學染色，無論是直接檢測轉染細胞，還是先將表達產物與存在C3d受體的Raji 細胞共孵育后再進行檢測，均為陽性反應，說明無論單體還是融合蛋白中Bin1b部分免疫識別表位保持良好，而C3d部分也未因與Bin1b的耦聯而喪失其與受體結合的生物學活性，表明該重組質粒轉染真核細胞后能夠正確表達。

綜上所述，本研究成功構建的pSG.SS.C3d3.YLBin1b能夠在真核細胞內進行表達，為后續研究Bin1b的高表達對受精過程的影響奠定了基礎。

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2 Chabory E, Damon C, Lenoir A, et al. Mammalian glutathione peroxidases control acquisition andmaintenance of spermatozoa integrity.J Anim Sci2010; 88(4): 1321-1331

3 Cao D, Li Y, Yang R,et al.Lipopolysaccharide-induced epididymitis disrupts epididymal beta-defensin expression and inhibits sperm motility in rats.Biol Reprod2010; 83(6): 1064-1070

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8 Zhou CX, Zhang YL, Xiao L,et al.An epididymisspecif c beta-defensin is important for the initiation of sperm maturation.Nat Cell Biol2004; 6(5): 458-464

9 Thornton BP, Vetvicka V, Ross GD. Function of C3 in a humoral response: iC3b/C3dg bound to an immune complex generated with natural antibody and a primary antigen promotes antigen uptake and the expression of costimulatory molecules by all B cells, but only stimulates immunoglobulin synthesis by antigen-specif c B cells.Clin Exp Immunol1996; 104(3): 531-537

10 Masilamani M, Kassahn D, Mikkat S,et al.B cell activation leads to shedding of complement receptor type II (CR2/ CD21).Eur J Immunol2003; 33(9): 2391-2397

（2014-07-15收稿）

Construction of eukaryotic recombinant plasmid pSG.SS.C3d3.YLBin1b and its expression in HEK293 cells*

Zhou Bo, Sun Zhongyi**, Jin Fengshuo, Li Yanfeng, Zhang Jun, Zhang Keqin
Department of Urology, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University,
Chongqing 400042, China

Sun Zhongyi, sun200801@hotmail.com; Tel: 023-68757946

ObjectiveTo construct the eukaryotic recombinant plasmid pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b and detect its expression in HEK293 cells.MethodsThe cDNA fragment of gene Bin1b was f rst produced by PCR, then inserted into the eukaryotic plasmid pSG.SS.C3d3.YL to form recombinant plasmid pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b. After the recombinant plasmid was conf rmed by restriction enzymes digestion analysis and sequence, it was transfected into HEK293 cells to express the target protein Bin1b. The expression of Bin1b was detected by immunof uorescence, Western blot, immunohistochemistry staining, and flow cytometry assay, respectively.ResultsThe transfected recombinant vector pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b expressed Bin1b protein in HEK293 cells.ConclusionThe successful expression of Bin1b in eukaryotic cells will establish a solid base for exploring the effect of high expression of Bin1b on the fertilization process.

eukaryotic cells; genetic vectors; gene expression; f uorescent antibody technique, indirect

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.001

R392

資助: 國家自然科學基金（81100546）; 重慶市自然科學基金（CSTC，2010BB5162）資助
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, E-mail: sun200801@hotmail.com; Tel: 023-68757946