單側隱睪后膠質細胞源性神經營養因子對另側睪丸保護的機制研究

王小翠張華鋒趙 佳

1. 山東省濰坊醫學院附屬益都中心醫院腎內科（青州 262500）;

2. 山東省青州市人民醫院泌尿外科; 3. 山東省濰坊醫學院附屬益都中心醫院腎內科

單側隱睪后膠質細胞源性神經營養因子對另側睪丸保護的機制研究

王小翠1張華鋒2*趙 佳3

1. 山東省濰坊醫學院附屬益都中心醫院腎內科（青州 262500）;

2. 山東省青州市人民醫院泌尿外科; 3. 山東省濰坊醫學院附屬益都中心醫院腎內科

目的大鼠單側隱睪模型后，探討膠質細胞源性神經營養因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）對另側睪丸組織中超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、白細胞介素-6（IL-6）及睪丸特異性鈣結合蛋白86-IV （testis -specif c calcium binding proten，TS- CBP86-IV）的影響和機制。方法選取左側隱睪造模成功雄性SD大鼠體質量（200±30）g，45只，隨機分為，A：隱睪組（n=15）；B：生理鹽水藥物組（n=15）；C：GDNF組（n=15）；D：另選正常對照組（n=15）。每組根據設定處理方式的不同分別進行處理。采集對側睪丸并行生化指標（SOD、CAT、MDA及IL-6含量）檢測；免疫組織化學檢測對側睪丸細胞凋亡指數（AI）；HE染色觀察對側睪丸組織學形態；定時PCR法檢測對側睪丸組織中TS-CBP86-IV mRNA的表達。結果膠質細胞源性神經營養因子藥物組（隱睪+GDNF組）生精細胞凋亡明顯減少，SOD活性上升，MDA含量下降，IL-6含量下降，TS- CBP86-IVmRNA基因表達明顯增強，其與A組、B組、D組比較，差異均有統計學意義。結論 GDNF對單側大鼠隱睪后對側睪丸生精功能具有保護作用，并提高抗氧化酶系統的抗氧化及降低血清炎癥因子能力，其機制可能與誘導TS-CBP86-IV基因表達有關。

隱睪; 膠質細胞源性神經營養因子; 睪丸特異性鈣結合蛋白CBP86-IV基因

單側隱睪時引起對側睪丸組織中生精上皮細胞損害、體內抗氧化能力下降，氧自由基攻擊造成生精細胞過度凋亡等一系列變化，可導致不育[1]。前期研究表明睪丸組織中睪丸特異性鈣結合蛋白CBP86-IV（testis -specif c calciumbinding proten, TS- CBP86-IV）降低時，睪丸生精能力也有所下降[2,3]。膠質細胞源性神經營養因子（glial cellderived neurotrophic factor, GDNF）是轉化生長因子超家族的一個相關成員，具有調節多種細胞株發育和分化的多功能信號分子，具有改善受損組織功能恢復。本實驗通過建立左側隱睪動物模型，探討GDNF對對側睪丸組織中TS- CBP86-IV mRNA表達情況及超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、白細胞介素-6（IL-6）的影響和可能發病機制。

資料及方法

一、資料

（一）主要試劑

凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；Revert Aid TM First Strand Cdna Synthesis和 PCR 試劑盒購自Fermentas公司；MDA、SOD、CAT及IL-6測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），GDNF（以色列Peprotech公司）。

（二）實驗動物分組

雄性SD大鼠體質量（200±30）g，由濰坊醫學院實驗中心提供，合格證號：SCXK2007-2009。造模成功后，選取符合實驗要求的45只大鼠隨機分為A、B、C組。A：隱睪組（n=15）；B：隱睪+生理鹽水組（n=15）；C：隱睪+GDNF組（n=15）；D：另選正常對照組（n=15）。

二、方法

（一）動物模型建立及分組

2%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，下腹正中小切口，游離左側睪丸，切除睪丸引帶，用8-0無創尼龍線將睪丸固定在腹壁上，分兩層關腹后成功造模，所有標本根據實驗設計要求分為4組。A組為隱睪組，B組是在A組的基礎上靜注生理鹽水（2ml/mg）qd，C組是在A組的基礎上通過尾靜脈緩慢注入GDNF液（5ng/mg）qd（參考Peprotech公司生產藥品說明書建議劑量），D組為正常對照組，標準食譜喂養，設計要求15d后處死大鼠，取右側睪丸，分別制作組織勻漿和石蠟切片。

（二）細胞凋亡、組織形態學檢測

應用原位缺口末端標記（TUNEL）法檢測睪丸上皮細胞凋亡情況，凋亡細胞核為棕黃色，陰性對照不加末端轉化酶，每張切片高倍鏡下隨機選取10個視野，計數視野下細胞數，再計數凋亡細胞數，計算凋亡指數（AI）。采集各組睪丸組織，置于4%中性甲醛溶液中浸泡固定24h，梯度酒精脫水，透明石蠟包埋，制備切片，常規HE染色，光鏡下行對側睪丸組織的形態學觀察。

（三）SOD、CAT、MDA IL-6含量檢測

取各組對側睪丸組織0.2g，用勻漿介質制成10%的組織勻漿，光法檢測CAT活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，酶聯免疫法測定IL-6血清含量，均操作嚴格按說明書進行。

（四）實時定量PCR檢測各組對側睪丸組織TSCBP86-IV mRNA表達情況

PCR擴增引物（TS- CBP86-IV）序列：

上游引物5'-ACGGAAGCAGTTGGTGGTCT-3'，下游引物5'-AACATCTGAGCAGCAAGCTGAG-3ˊ；內參GAPDH引物序列，上游引物5'-GCCAAGGTCA TCCATGACAACTTTGG-3'，下游引物5'-GCCTGCT TCACCACCTTCTTGATGTC-3'，收集各組對側睪丸組織，提取組織中總RNA，參照Revert Aid TM First Strand Cdna Synthesis說明書，進行逆轉錄反應，操作嚴格按照試劑盒說明要求進行。所得數據分析均由FTC-2000分析軟件自動進行，所得靶基因相對含量=2-（Ct靶基因-CtGAPDH）×103，其中GAPDH為內參照。

三、統計學方法

采用t檢驗，運用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。

結 果

一、細胞凋亡檢測

隱睪組對側睪丸見細胞結構層次紊亂，大量生精細胞凋亡（圖1A）。與A組比較，B組對側睪丸生精細胞排列紊亂，部分生精細胞脫落、胞漿濃縮，生殖細胞凋亡較明顯，間質增多（圖1B）。C組對側睪丸生精小管結構較為完整，生精細胞層次稍有紊亂、間質明顯減少，生精細胞凋亡較A組、B組明顯減少（圖1C），D組未見生殖細胞凋亡（圖1D）。免疫組織化學檢測A組、B組、C組、D組的對側睪丸細胞凋亡指數（AI）值分別為13.51±0.63、10.98±0.17、7.32 ±0.05、3.14±0.09。

二、各組睪丸組織形態學觀察

HE染色證實，對照組未見間質水腫和血管擴張（圖2A）。生理鹽水組中間質水腫減輕，粒細胞可見（圖2B）。隱睪組，被膜血管擴張明顯，大量中性粒細胞浸潤，生精小管結構紊亂、變性壞死增多，間質重度水腫（圖2C）。膠質細胞源性神經營養因子藥物組，被膜血管無充血擴張，未見粒細胞浸潤，生精小管變性壞死和間質水腫明顯改善（圖2D）。

圖1 另側各組睪丸組織細胞凋亡情況(HE×200)

圖2 另側各組睪丸組織細胞形態學觀察情況(HE×200)

三、SOD、CAT、MDA、IL-6含量檢測

C組對側睪丸抗氧化酶SOD、CAT活性顯著高于A組、B組，而MDA、IL-6含量顯著低于A組、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；D組抗氧化酶SOD、CAT活性明顯高于隱睪組、生理鹽水組，而MDA、IL-6含量明顯低于A組、B組間比較有明顯統計學差異（P＜0.01）；而A組與C組各項指標均無明顯統計學意義（表1）。

表1 各組大鼠對側睪丸組織中CAT、 SOD 、MDA、IL-6含量比較

四、RT-PCR檢測各組對側睪丸組織TS- CBP86-IVmRNA

各組對側睪丸，TS- CBP86-IV基因相應片段大小的位置均出現條帶，TS- CBP86-IV基因的條帶強度均比內參GAPDH條帶的強度明顯要弱，與A組條帶相比，其他各組條帶明顯增強，其C組亮度明顯強于D組， A組、B組、C組、D組TS- CBP86-IV mRNA表達含量分別為0.35±0.11、0.43±0.23、0.81±0.05、0.59 ±0.33。C組與A、B、D組，A組與D組，B組與D組間比較均有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3

討 論

膠質細胞源性神經營養因子最先從大鼠膠質細胞B49的條件培養液中分離出來并被命名（glial cellderived neurotrophic factor，GDNF）。研究表明，GDNF被定作為腸神經元突觸小泡的一個標記，通過GFR-1或神經細胞黏附因子從而激活細胞內信號通路，發揮生物學意義[4,5]，GDNF對PD、腦缺血、神經性疼痛、感覺纖維再生的作用已有大量研究。本人[6]研究發現GDNF對大鼠隱睪損傷側睪丸組織生精功能有保護作用，進一步顯示膠質細胞源性神經營養因子誘導睪丸精原干細胞增值和分化遷移/祖細胞有一定的調控作用，此與國外學者研究結果基本一致[7,8]。GDNF是TGF-β超家族的一個相關成員，在腦內廣泛分布，通過其受體復合物介導激活細胞內信號轉導通路，發揮維持神經元功能和損傷修復等作用，成為潛在的治療腦部疾病靶點之一。

在哺乳動物試驗研究中，外源性GDNF能促進精原干細胞（spermatogonial stem cells, SSCs）的自我更新與增殖，可能通過以下作用：GDNF與GFR-α1特異性結合,活化Ret蛋白酪氨酸激酶，隨后激活Ras/ ERK1/2、PI3K-Akt和SFK信號通路，促進SSCs的自我更新；同時，在該過程中還可能存在信號通路間的交聯對話現象。

TS-CBP86-IV表達上調可能與抗氧化酶活性下降、生精細胞凋亡有關。TS- CBP86-IV可能參與了生精細胞的凋亡和隱睪的病理過程。本研究通過建立大鼠隱睪模型后，進一步探討了GDNF對大鼠對側睪丸組織中TS- CBP86-IV基因表達及SOD、CAT、MDA和IL-6的表達特點，結果應用GDNF藥物后，抗氧化酶SOD、CAT活性明顯高于隱睪組、生理鹽水組，MDA、IL-6含量明顯低于隱睪組、生理鹽水組，兩組間比較均有明顯統計學意義（P＜0.05）。睪丸損傷后抗氧化酶系統已遭破壞，從而啟動了凋亡程序，觀察其組織病理凋亡及形態學改變，可見A組被膜血管擴張明顯，大量中性粒細胞浸潤，生精小管結構紊亂、變性壞死增多，此與文獻報道基本一致[9,10]。應用GDNF后睪丸生精小管結構較為完整，生精細胞層次無明顯紊亂。RT-PCR發現，應用GDNF治療后，單側大鼠隱睪對側睪丸組織中TS- CBP86-IV基因表達條帶亮度明顯增強，說明GDNF參與對側睪丸生精細胞的增值和分化作用，對睪丸功能有保護作用。

當然本研究存在缺陷和不足，應設計作用于單側隱睪損傷后另側睪丸的不同關鍵時間點，并給予GDNF干預治療，觀察相應變化，應對不同給藥方法和劑量進行試驗設計并觀察另側睪丸組織中各項指標動態變化情況。GDNF對大鼠單側隱睪后對側睪丸生精功能具有保護作用，并提高抗氧化酶系統的抗氧化及降低血清炎癥因子能力，可能是通過誘導TSCBP86-IV基因表達而實現，但如何誘導及調控等問題有待大樣本量進一步深入研究探討。

1 朱保平, 鄭新民, 李世文, 等. 大鼠單側隱睪對側睪丸的損害與抗氧化酶mRNA的表達. 中華實驗外科雜志2004; 21(5): 575-576

2 申樹林, 梁季鴻, 朱春暉, 等. 睪丸特異性鈣結合蛋白CBP86-IV表達水平變化及抗體制備. 中國男科學雜志2013; 27(10): 61-62, 66

3 徐明, 鄭新民, 丁協剛, 等. SCF/c-kit基因在隱睪大鼠睪丸中的表達及其意義. 中華實驗外科雜志 2011; 28(5): 781-783

4 Turner TT, Bang HJ, Lysiak JL. The molecular pathology of experimental testicular torsion suggests adjunct therapy to surgical repair.J Urol2004; 172(6 Pt 2): 2574-2578

5 B?ttner M, Harde J, Barrenschee M,et al. GDNF induces synaptic vesicle markers in enteric neurons.Neurosci Res2013; 77(3): 128-136

6 張華鋒, 趙佳. 睪丸損傷后膠質細胞源性神經營養因子對損傷睪丸的保護和修復的探討. 中國男科學雜志2013; 27(10): 20-24

7 Dovere L, Fera S, Grasso M,et al. The niche-derived glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) induces migration of mouse spermatogonial stem/progenitor cells.Plos one2013; 8(4): e59431

8 Ferranti F, Muciaccia B, Ricci G,et al.Glial cell linederived neurotrophic factor promotes invasive behaviour in testicular seminoma cells.Int J Androl2012; 35(5): 758-768

9 Saba M, Morales CR, De Lamirande E,et al. Morphological and biochemical changes following acute unilateral testicular torsion in prepubertal rats.J Urol1997; 157(3): 1149-1154

10 Bianchi R, Giambanco I, Donato R. S100B/RAGE-dependent activation of microglia via NF-KappaB and AP-1 coregulation of COX-2 expression by S100B, IL-6 beta and TNF-alpha.Neurobiol Aging2010; 31(4): 665-677

（2014-03-28收稿）

Effects of glial cell source derived neurotrophic factor in unilateral cryptorchidism on the contralateral testis and its mechanism

Wang Xiaocui1, Zhang Huafeng2*, Zhao Jia3
1. Department of Renal Medicine, Yidu Central Hospital,Weifang Medical College, QingZhou 262500, China;
2. Department of Urology Surgery, Qingzhou Peoples Hospital; 3. Department of Renal Medicine, Yidu Central Hospital,
Weifang Medical College

ObjectiveTo investigate the effects of glial cell source derived neurotrophic factor on the levels of testis -specif c calciumbinding proten CBP86-IV and SOD, CAT, MDA, IL-6 in the contralateral testis in rats.MethodsTotal of 45 male mice model with left cryptorchidism were randomly divided into three groups such as group A(cryptorchidism group n=15), group B(NS n=15 ), group C (GDNF n=15 ) and group D(the normal contral group n=15). They were killed and the right testis was took out and then its biochemical index was examined including superoxide dismutase(SOD), the activity of catalase(CAT) and level of malonic diethylaldehyde(MDA), interleukin-6(IL-6); Germ cell apoptosis was detected by immunohistochemistry; The histological changes were observed by microscope. The expression of TS- CBP86-IV was detected by real-time quantitative PCR.ResultsCompared with those of other group,the percentage of apoptotic germcells and the content of MDA and IL-6 were markedly decreased in erdosteine group,but the levels of SOD and CATwere signif cantly increased. The mRNA expression of TS- CBP86-IV was also enhanced.ConclusionGlial cell derived neurotrophic factor(C group) shows protective effects on contralateral testis. This effect may be achieved through repressing the generation of oxygen-derived free radicals and high expression of TS- CBP86-IV.

Cryptorchidism; glial cell line-derived neurotrophic factor; testis -specif c calcium binding protein CBP86-IV gene

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.004

R 697.22; R 339.211

*通訊作者, E-mail: zhanghuafeng09@126.com; Tel: 15063608578

Corresponding autor: Zhang Huafeng, E-mail, zhanghuafeng09@126.com; Tel: 15063608578