人尿道狹窄組織的中成纖維細(xì)胞中相關(guān)因子在γ射線作用前后表達(dá)研究

屈衛(wèi)星 李 晶 程永毅 徐永剛

陜西省人民醫(yī)院泌尿外科（西安 710068）

人尿道狹窄組織的中成纖維細(xì)胞中相關(guān)因子在γ射線作用前后表達(dá)研究

屈衛(wèi)星 李 晶 程永毅 徐永剛

陜西省人民醫(yī)院泌尿外科（西安 710068）

目的研究人尿道狹窄組織中的成纖維細(xì)胞中iNOs、HSP47、MMP-1和MMP-2在放射線作用前后表達(dá)的變化。方法取材于人尿道狹窄段的新鮮瘢痕組織，并使用消化法與超速貼壁法分離出瘢痕成纖維細(xì)胞，在穩(wěn)定傳代5～6代后，給予5Gy單次銥192γ射線照射后，使用Western-blotting半定量分析照射前后iNOs，HSP47，MMP-1和MMP-2的表達(dá)情況。結(jié)果人尿道狹窄段的瘢痕成纖維細(xì)胞在接受固定安全劑量單次照射后，在24h時(shí)，iNOs與HSP47表達(dá)降低，MMP-1和MMP-2表達(dá)升高；在48h時(shí)，iNOs表達(dá)升高，HSP47持續(xù)表達(dá)降低，MMP-1和MMP-2持續(xù)表達(dá)升高。結(jié)論 取材于人尿道狹窄瘢痕中的成纖維細(xì)胞經(jīng)放射線照射后的生物學(xué)指標(biāo)iNOs處于調(diào)節(jié)上游，呈時(shí)相上的雙向調(diào)節(jié)機(jī)制，處于下游的HSP47的表達(dá)受抑制，MMP-1和MMP-2表達(dá)受激活，可能在抑制成纖維細(xì)胞的增殖、減少膠原的穩(wěn)定合成和促進(jìn)細(xì)胞外堆積膠原的分解3個(gè)方面有效抑制瘢痕增生。

銥放射性同位素; γ射線; 尿道狹窄; 一氧化氮合酶; 基質(zhì)金屬蛋白酶類; HSP47熱休克蛋白質(zhì)類; 成纖維細(xì)胞

尿道狹窄術(shù)后預(yù)防復(fù)發(fā)一直以來(lái)都是令泌尿外科臨床醫(yī)生感到棘手的問(wèn)題。Chiou等[1]利用超聲圖像，根據(jù)尿道狹窄的海綿體累及程度以及尿道狹窄的長(zhǎng)度，把尿道狹窄分為5級(jí)：Ⅰ度：較短的狹窄（＜2.5cm）累及最小程度的海綿體組織。Ⅱ度：較短的狹窄伴有累及中等程度（有剩余部分海綿體組織環(huán)繞在病變尿道周圍）的海綿體組織。Ⅲ度：較短的狹窄并累及大范圍（全層）海綿體。Ⅳ度：較長(zhǎng)（＞2.5cm）的狹窄或者合并伴有中等程度的海綿體組織累及。Ⅴ度：較長(zhǎng)（＞2.5cm）的狹窄或者合并伴有大范圍的海綿體累及。尿道狹窄的復(fù)發(fā)與局部的瘢痕細(xì)胞的形成和增殖密切相關(guān)，在瘢痕細(xì)胞的形成和增殖過(guò)程中，促進(jìn)膠原合成與分解相關(guān)的成纖維細(xì)胞中的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inductiblenitric oxide synthase, iNOs）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matric metallo proteinases, MMPs）之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，造成膠原過(guò)多堆積，熱休克蛋白47（ Heat Shock Proteins-47，HSP-47）也參與了瘢痕形成過(guò)程中膠原蛋白的堆積[2]。已有研究證實(shí)γ射線能有效抑制瘢痕增生，并且已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療瘢痕過(guò)度增生的疾病[3]。本文擬從細(xì)胞水平解釋闡明γ射線抑制瘢痕細(xì)胞增生可能的過(guò)程及原理。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

男性尿道狹窄瘢痕段（Ⅰ度-Ⅲ度）切除術(shù)后標(biāo)本（我中心提供）；β-actin抗體、Marker（美國(guó)），HSP47鼠抗（人）單克隆抗體、MMP-1鼠抗（人）單克隆抗體、MMP-2鼠抗（人）單克隆抗體、iNOs 鼠抗（人）單克隆抗體、羊抗鼠IgG二抗（北京博奧森）。銥192γ射線源（我院放療科提供）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）男性尿道狹窄段組織成纖維細(xì)胞的分離

將組織塊標(biāo)本于含有抗生素的PBS液中反復(fù)沖洗數(shù)遍，去除多余的上皮組織；將組織小塊分解5mm ×5mm大小的組織小塊并適當(dāng)向組織上滴加培養(yǎng)基使其保持濕潤(rùn)。送入離心管中，加入0.25%胰酶消化液-EDTA和膠原酶-Ⅰ，在37℃恒溫水浴箱中消化4～5h，每1h振蕩1次。滴加1滴細(xì)胞混懸液在載玻片上，倒置顯微鏡下可觀察到有離散的細(xì)胞，并在紅細(xì)胞計(jì)數(shù)器下計(jì)算細(xì)胞密度。將成纖維細(xì)胞混懸液勻速滴加在燒杯上濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，取濾過(guò)后的成纖維細(xì)胞混懸液170.2×g，離心5min；棄去上清液，加入6mL的新鮮培養(yǎng)液，充分吹打細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）培養(yǎng)。次日絕大部分成纖維細(xì)胞己貼壁，換細(xì)胞培養(yǎng)基，每隔2～3d給細(xì)胞換液1次。

（二）細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞密度約為70%～80%時(shí)，可傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下可觀察到樹突狀及梭狀成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。

（三）細(xì)胞的凍存

在超凈臺(tái)中，將90%胎牛血清和10%的二甲基亞礬混合凍存液，4℃冰箱中保存。鏡下觀察細(xì)胞呈對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，即鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底的70%，用0.25%胰酶消化液-EDTA消化，待瓶底細(xì)胞鏡下漂浮起來(lái)，棄掉消化液，用凍存液吹打均勻，細(xì)胞懸液分裝入預(yù)先消毒好的凍存管中，每管1mL；采用“慢凍速融”的原則，分別將凍存管置于4℃、-20℃、-80℃環(huán)境中各2h，然后置于液氮罐中。

（四）細(xì)胞的復(fù)蘇

取出冷凍管，迅速放入37℃水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，在1min內(nèi)使其完全融化，然后在無(wú)菌下取出細(xì)胞。在169.2×g速度下離心10min，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度0.5×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。

（五）成纖維細(xì)胞不同時(shí)間段照射后繼續(xù)觀察培養(yǎng)

使用銥192γ射線單次5Gy劑量照射后24h，48h后繼續(xù)觀察培養(yǎng)。

（六）單層貼壁成纖維細(xì)胞總蛋白的提取與Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中的相關(guān)因子的表達(dá)

單層貼壁成纖維細(xì)胞總蛋白的提取后SDS-PAGE電泳，終止電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。然后免疫反應(yīng)（使用雜交袋進(jìn)行一抗和二抗的孵育），用化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。

結(jié) 果

使用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中的相關(guān)因子的表達(dá)，與未處理的尿道瘢痕細(xì)胞相比較，在經(jīng)過(guò)單次使用5Gy的劑量放射線照射24h后，iNOs與HSP47表達(dá)量降低， 而MMP-1與 MMP-2表達(dá)量升高；48h后，iNOs表達(dá)量稍升高，HSP47表達(dá)量持續(xù)降低，MMP-1與 MMP-2表達(dá)量持續(xù)升高，見圖1至圖4。

圖1 iNOs在細(xì)胞中的印跡表達(dá)

圖2 HSP47在細(xì)胞中的印跡表達(dá)

圖3 MMP-1在細(xì)胞中的印跡表達(dá)

圖4 MMP-2在細(xì)胞中的印跡表達(dá)

討 論

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在取材于人尿道瘢痕組織中的細(xì)胞水平上，放射線照射后在細(xì)胞信號(hào)通路上的效應(yīng)是可以抑制瘢痕細(xì)胞增生的。

本研究所涉及可誘發(fā)瘢痕成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖的正向調(diào)控細(xì)胞因子iNOS和HSP-47。其中以組織中iNOS產(chǎn)生的NO通過(guò)調(diào)節(jié)膠原蛋白的合成作用促進(jìn)瘢痕疙瘩形成[4]。且在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中給予外源性NO通過(guò)cGMP方式刺激Ⅰ型膠原的表達(dá)以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的生成[5]，從而形成瘢痕組織。而HSP47是一種獨(dú)特的膠原特異性分子伴侶[6]。HSP47在纖維化發(fā)病機(jī)制中有明確相關(guān)性。據(jù)研究表明，在肺，腎和肝的纖維化和瘢痕疙瘩中已發(fā)現(xiàn)了HSP47的表達(dá)增加。這些發(fā)現(xiàn)表明HSP-47參與了瘢痕疙瘩形成過(guò)程中膠原蛋白的堆積。

同樣在瘢痕成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖中扮演負(fù)向調(diào)控的相關(guān)因子是MMPs。MMP-1參與與肉芽組織和瘢痕形成密切相關(guān)的組織改建過(guò)程，MMP-1是蛋白質(zhì)家族中最為特殊的一種酶，可以在單一位點(diǎn)分解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原的三股螺旋分子，使其解旋，之后酶被明膠酶繼續(xù)降解，從而增加了纖維源性細(xì)胞生長(zhǎng)因子的釋放及活性作用；再者，細(xì)胞外過(guò)量沉積的膠原也可誘導(dǎo)MMP-1的大量表達(dá)[7,8]。MMP-2就是分解特殊的膠原蛋白-明膠。此酶可分解與膠原蛋白（明膠，膠原，層粘連蛋白）相連，C-端含有二型纖維粘連蛋白中3個(gè)重復(fù)部分，同時(shí)可分解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原分子[9,10]。從理論上講，過(guò)量表達(dá)的MMPs可促使Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原降解，抑制病理性瘢痕細(xì)胞的形成。

研究表明一氧化氮信號(hào)通路對(duì)瘢痕疙瘩形成的潛在影響，從病人身體中分離出來(lái)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞被用作一個(gè)模型系統(tǒng)。該報(bào)告對(duì)NO/cGMP信號(hào)通路對(duì)誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的纖維化因子（TGF-β，TIMP-1和HSP47）的表達(dá)效果進(jìn)行了觀察，結(jié)果是正向調(diào)控，即I型膠原蛋白受到外源性一氧化氮的刺激，NO/cGMP信號(hào)通路中TGF-β的增加將激活SMAD信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而增加瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP-1）和HSP-47的表達(dá)增加。

在放射線照射下24h后，在通路中，iNOs的表達(dá)的顯著降低明顯抑制與瘢痕修復(fù)相關(guān)的正向調(diào)節(jié)因子TGF-β與HSP47的生成。

此外，由iNOs生成NO還可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)和活性[11,12]。使用大鼠腎小球系膜細(xì)胞作為研究對(duì)象的報(bào)告表明，NO在抑制膠原合成的同時(shí)，可能會(huì)增加基質(zhì)金屬蛋白酶的生成和活性[13,14]。數(shù)據(jù)表明，NO將增加細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶-1的活性，分泌自AG皮膚成纖維細(xì)胞的蛋白水平與本研究結(jié)果一致。NO對(duì)膠原合成的抑制作用也可以通過(guò)其他機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)。NO對(duì)兔子關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的脯氨酰羥化酶（膠原蛋白經(jīng)翻譯后加工的一種重要酶）進(jìn)行調(diào)節(jié)[15]。

綜上所述，NO通過(guò)以下途徑直接抑制膠原合成，這些途徑包括脯氨酸羥基化，刺激MMPs，降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的生成[16,17]，啟動(dòng)成纖維細(xì)胞凋亡，和（或）中和蛋白纖維化活性氧物種。在放射線照射48h后，放射線作用的生物學(xué)途徑中iNOs的表達(dá)再度上升和MMPs的持續(xù)高表達(dá)是在抑制瘢痕膠原堆積塑形中起到明顯的作用。

我們能從動(dòng)物模型的組織因子研究水平上和人離體尿道瘢痕細(xì)胞因子分泌在銥192γ射線照射后的變化存在一致性[18,19]，由此認(rèn)為銥192γ射線對(duì)尿道瘢痕的生長(zhǎng)有一定抑制作用。雖然已經(jīng)有應(yīng)用于臨床的報(bào)道[20]，但其放射劑量的調(diào)控、效果的穩(wěn)定性及遠(yuǎn)期的副作用尚待循證醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步闡明。

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（2014-03-15收稿）

The expression of the related factors derived from f broblasts in the human’s urethral stricture tissue expose to γ radiation

Qu Weixing, Li Jing, Cheng Yongyi, Xu Yonggang
Department of Urology, Shaanxi Provincial People's Hospital, Xi'an 710068, Shaanxi, China

ObjectiveTo detect the expressions of iNOs, HSP47, MMP-1 and MMP-2 in f broblasts of urethral stricture tissue expose toγRadiation.MethodsFresh scar tissue of urethral stricture section was collected and the f broblasts were isolated using the digestion method and speeding adherence method.The isolated cells weresubcultured 5-6 generations and exposed to the radiation with the frequency of 5Gy/1 times. The expression of iNOs, HSP47, MMP-1 and MMP-2 before and after the radiation were measured by western blot.ResultsUnder the single radiation with f xed safety dose, scar f broblasts had lower expression of iNOs and HSP47, and higherexpression of MMP-1 and MMP-2 at the time of 24h; at the time of 48h, the treated cells had higher expression of iNOs, continuously lower expression of HSP47, and continuously higher expression of MMP-1 and MMP-2.ConclusionThe expression of- iNOs in f broblasts in exposure to radioactive rays presents the time-phase and two-way regulatory mechanism, and the expression of HSP47, at the downstream, is downregulated. The expressions of MMP-1 and MMP- 2 are upregulated, which may effectively inhibit the scar proliferation by inhibiting the proliferation of f broblasts, reducing the stable synthesis of collagen, and accelerating the decomposition of extracellular accumulation collagen.

iridium radioisotopes; gamma rays; urethral stricture; nitric oxide synthase; matrix metalloproteinases; HSP47 heat-shock proteins; f broblasts

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.005

R 339.57; R 695.4