人工牛黃抗口腔纖維化效應(yīng)及機(jī)制初探

朱丹霞 代劍平* 萬倩英 陳小璇 王革非 李康生

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室，廣東 汕頭 515031）

人工牛黃抗口腔纖維化效應(yīng)及機(jī)制初探

朱丹霞 代劍平* 萬倩英 陳小璇 王革非 李康生

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室，廣東 汕頭 515031）

目的研究人工牛黃抗檳榔誘導(dǎo)的口腔纖維化的效應(yīng)及藥理機(jī)制。方法培養(yǎng)小鼠口腔黏膜成纖維細(xì)胞、氯胺T法、明膠酶譜分析、qRT-PCR、ELISA和Western blotting等。結(jié)果人工牛黃可抑制檳榔提取物（Areca nut extract，ANE）誘導(dǎo)的口腔黏膜成纖維細(xì)胞的異常增殖及膠原累積。藥理研究顯示，人工牛黃可顯著拮抗ANE誘導(dǎo)的MMP2活性下降和膠原基因的表達(dá)上調(diào)，抑制ANE誘導(dǎo)的TIMP-1和TIMP-2基因表達(dá)，及CTGF、TGFβ1、IL-6和TNFα的轉(zhuǎn)錄及釋放，抑制ANE誘導(dǎo)的AKT、ERK/JNK MAPK和NF-κB信號通路的活化及氧化應(yīng)激。結(jié)論人工牛黃具有良好的抗纖維化作用，是一種很有應(yīng)用前景的抗口腔黏膜纖維化藥物。

牛黃；檳榔；口腔黏膜纖維化；抗纖維化

長期嚼食檳榔可誘發(fā)口腔黏膜纖維化（OSF），其病理特征是口腔黏膜下胞外基質(zhì)異常積累，并伴炎性細(xì)胞浸潤和上皮萎縮[1]。檳榔提取物（Areca nut extract，ANE）可誘導(dǎo)TGFβ、IL-6和前列腺素E2分泌，上調(diào)COX-2和波形蛋白表達(dá)，激活PI3K/Akt、PKCα、ERK/ JNK/p38 MAPK和NF-κB信號通路，與OSF的發(fā)生和進(jìn)一步癌變密切相關(guān)[2,3]。天然牛黃（Calculus bovis）由牛科牛（Bubalus bubalis L.）干燥膽結(jié)石加工而來，現(xiàn)臨床常用人工牛黃。牛黃能抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖[4]，其主要成分牛磺酸能抑制肝、胰、腎、肺和心纖維化，并具抗腫瘤活性[5,6]。牛黃膽紅素可抑制腎和肺纖維化[7,8]。為預(yù)防和治療檳榔誘導(dǎo)的OSF，我們研發(fā)了一種咀嚼片，牛黃是其主要成分之一[9]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)牛黃可抑制正常培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，抑制金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）-1產(chǎn)生[10]，本研究進(jìn)一步揭示人工牛黃抗ANE誘導(dǎo)OSF的效應(yīng)及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人工牛黃（Calculus bovis，CB）購自鎮(zhèn)江存仁堂有限責(zé)任公司，批號095072。檳榔購自毫州中藥材市場（批號096108，安徽），經(jīng)江蘇大學(xué)韓幫興博士鑒定并于本實驗室保存。檳榔提取物（ANE）參照中國藥典（2005版）。高效液相色譜（LC200，JASCO，日本）測定人工牛黃含膽紅素0.67%，檳榔提取物含檳榔堿0.31%。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和MTT實驗

Balb/c小鼠[（20±2）g，雌雄各半]正常飼養(yǎng)1周，頸椎脫臼處死，無菌取口腔黏膜，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法參照之前報道[10]。實驗方案經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心審批。牛黃（CB）和ANE對小鼠口腔黏膜成纖維細(xì)胞生長的影響用MTT法測定[10]。CB系列濃度（0、12.5、25、50、100、200 μg/mL）和ANE系列濃度（6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL）用10% FCS DMEM培養(yǎng)液配制，DMSO≤0.5%。藥物處理48 h，空白對照為10% FCS DMEM培養(yǎng)液（DMSO=0.5%）。

1.3 羥脯氨酸測定

小鼠口腔黏膜成纖維細(xì)胞（1×105/孔）接種24孔板，24 h，再加含ANE（1.25、2.5、5、10、20 μg/mL）10% FCS DMEM培養(yǎng)液，同時加或不加12.5 μg/mL CB，48 h；收集上清，氯胺T法測羥脯氨酸含量[10]。膠原蛋白量用μg/106個細(xì)胞表示，假定膠原蛋白含13.5%羥脯氨酸。

1.4 明膠酶譜分析

細(xì)胞處理同羥脯氨酸測定，收集上清，用于明膠酶譜分析和ELISA測定；收集細(xì)胞用于qRT-PCR和Western blotting分析。MMP-2/-9活性用Bandscan軟件進(jìn)行灰度掃描并用面積乘平均灰度值表示[10]。

1.5 實時定量PCR（qRT-PCR）

細(xì)胞處理同羥脯氨酸測定，Trizol提取總RNA，核酸酶DNase I處理，反轉(zhuǎn)錄并做實時定量PCR。試劑盒購自Invitrogen并按說明書進(jìn)行。引物設(shè)計用Primer Express 3.0軟件（表1）。結(jié)果表示為2-ΔΔCt。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）

細(xì)胞處理同羥脯氨酸測定，ELISA試劑盒（北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）測定上清液CTGF、TGFβ1、IL-6、TNF-α和IL-1水平。細(xì)胞因子水平用pg/mL表示。

1.7 抗氧化測定

細(xì)胞處理同羥脯氨酸測定，還原型谷胱甘肽 （GSH），丙二醛（MDA），一氧化氮（NO），羥自由基（OH），總超氧化物歧化酶（T-SOD），谷胱甘肽還原酶（GR），過氧化氫酶（CAT）以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平的測定均用相關(guān)試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定。

1.8 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）

細(xì)胞處理同羥脯氨酸測定，抗Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、和NF-κB p65抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗山羊二抗均購自CST公司（美國）。檢測NF-κB p65時，提取細(xì)胞核蛋白。蛋白質(zhì)濃度測定用BCA蛋白測定試劑盒（碧云天，中國），20 μg蛋白質(zhì)上樣用于SDS-PAGE電泳[11]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS13.0單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié) 果

2.1 CB拮抗ANE誘導(dǎo)的口腔黏膜成纖維細(xì)胞異常增長

如圖1A示，CB可劑量依賴性地抑制成纖維細(xì)胞增長，在≤12.5 μg/mL時無明顯細(xì)胞毒性。如圖1B示，在低濃度（6.25～12.5 μg/mL）下，ANE可顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞增長，而在高濃度（50～400 μg/mL）下，ANE又能顯著抑制細(xì)胞增長。CB（12.5 μg/mL）能有效拮抗ANE效應(yīng)。

圖1 牛黃（CB）拮抗ANE誘導(dǎo)的口腔黏膜成纖維細(xì)胞異常增長。（A）MTT法測定CB的細(xì)胞毒性。（B）CB拮抗ANE誘導(dǎo)的口腔黏膜成纖維細(xì)胞異常增長。n=5， *P＜0.05和**P＜0.01與相同ANE濃度的僅ANE處理的對照組相比。

2.2 CB拮抗ANE誘導(dǎo)的MMP2活性下降，膠原蛋白及TIMP1-/-2表達(dá)上調(diào)和膠原累積

ANE可顯著抑制人口腔黏膜成纖維細(xì)胞MMP-2分泌，提高TIMP-1表達(dá)，誘導(dǎo)胞外膠原異常沉積[12]。本研究顯示（圖2A），ANE在2.5～20 μg/mL范圍內(nèi)可顯著促進(jìn)膠原累積，CB（12.5 μg/mL）能有效抑制ANE誘導(dǎo)的膠原蛋白積累。明膠酶譜分析顯示（圖2B、C和D），ANE能顯著抑制MMP-2和MMP-9的活性，CB（12.5 μg/mL）能顯著提高ANE（12.5 μg/mL）抑制的MMP-2活性。qRT-PCR結(jié)果顯示（圖2E），ANE（12.5 μg/mL）可顯著促進(jìn)口腔黏膜成纖維細(xì)胞Col1A1、Col3A1、TIMP1和TIMP-2表達(dá)。CB可顯著抑制ANE刺激的Col1A1、Col3A1、TIMP1和TIMP-2表達(dá)。

2.3 CB對ANE誘導(dǎo)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄和釋放的影響

CTGF、TGFβ1、IL-6、IL-1和TNF-α對OSF的發(fā)生有重要作用[13]。本研究qRT-PCR和ELISA檢測顯示（圖3），ANE能顯著促進(jìn)CTGF、TGFβ1、IL-6和TNFα的轉(zhuǎn)錄和釋放，CB能顯著抑制ANE誘導(dǎo)的這些細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄和釋放，但對IL-1無顯著作用。

2.4 CB抑制ANE誘導(dǎo)的AKT、ERK/JNK MAPK 和 NF-κB信號通路的激活

ANE可激活PI3K/AKT、ERK/JNK/p38 MAPK 和 NF-κB信號通路[2,3]。本研究顯示（圖4），ANE能顯著提高p-Akt、p-ERK、p-JNK、p-p38及細(xì)胞核NF-κB p65水平，CB可顯著抑制PI3K/AKT、 ERK/JNK MAPK 和 NF-κB通路的激活，而對p38 MAPK通路無顯著影響。

圖2 CB拮抗ANE誘導(dǎo)的MMP2活性下降，膠原蛋白及TIMP1-/-2表達(dá)上調(diào)和膠原累積。（A）氯胺T法測定CB對ANE誘導(dǎo)膠原蛋白積累的影響。n=5，*P＜0.05和**P＜0.01與相同ANE濃度的僅ANE處理的對照組相比。（B、C和D）明膠酶譜試驗，泳道1（空白）：10% FCS；泳道2（模型組）：10% FCS + ANE（12.5μg/mL）；泳道3：10% FCS + ANE（12.5 μg/mL）+ CB（12.5 μg/mL）；泳道4：10% FCS+ANE（12.5 μg/mL）+CB（6.25 μg/mL）。（E）qRT-PCR測定結(jié)果。

表1 qRT-PCR試驗所用引物序列

2.5 CB抑制ANE誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

ANE能促進(jìn)活性氧（ROS）產(chǎn)生，降低谷胱甘肽（GSH）水平，并在OSF發(fā)生中扮演重要角色[9，10]。本研究顯示（表2），ANE可顯著降低GSH水平，促進(jìn)NO 和HO·產(chǎn)生，抑制GR、CAT 和 GSH-Px活性。相反，CB能顯著拮抗ANE誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖3 CB影響ANE誘導(dǎo)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄和釋放。（A）qRT-PCR試驗結(jié)果，（B）ELISA試驗結(jié)果，n＝5，*P＜0.05和**P＜0.01同10% FCS＋ANE（12.5 μg/mL）組相比。

圖4 CB對ANE誘導(dǎo)的AKT、ERK/JNK/p38 MAPK 和 NF-κB通路的影響。n=3，*P＜0.05和**P＜0.01同10% FCS＋ANE（12.5 μg/mL）組相比。

表2 牛黃對ANE誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響

3 討 論

嚼食檳榔是OSF及口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的重要因子。為此，我們研發(fā)了一種中藥配方以治療OSF，CB是其主要成分之一。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CB可劑量依賴性地抑制小鼠口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖，在藥效藥理試驗中，我們選擇低濃度12.5 μg/mL作為牛黃實驗濃度，因為這個濃度的CB對口腔黏膜成纖維細(xì)胞無明顯毒性。此外，低濃度ANE能有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，高濃度ANE表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性。

MMPs和TIMPs能嚴(yán)密控制膠原積累[13]。人MMPs家族含23個成員，以MMP-2和MMP-9為代表的膠原酶，能降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)。TIMPs是MMPs強(qiáng)有力的抑制劑。TIMP家族有四個成員，其中TIMP-1和TIMP-2以自由形式存在，TIMP-1和TIMP-2能以1∶1的比例結(jié)合MMPs，抑制MMPs的活性[13]。本研究顯示CB能拮抗ANE誘導(dǎo)的MMP-2活性的下降及TIMP-1/-2水平的上調(diào)。此外，CB還顯著降低CTGF、TGFβ1、IL-6及TNFα等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄與釋放，這些皆與OSF的發(fā)生密切相關(guān)。

現(xiàn)代研究顯示，氧化應(yīng)激可激活PI3K/Akt、MAPK及NF-κB等信號通路，并且這些信號通路的激活可調(diào)節(jié)MMPs和TIMPs表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控膠原積累[14]。根據(jù)本研究實驗結(jié)果，我們推測CB可通過抑制ANE誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制PI3K/Akt、ERK/JNK MAPK及NF-κB信號通路，通過調(diào)節(jié)MMPs和TIMPs表達(dá)，最終抑制胞外基質(zhì)積累和ANE誘導(dǎo)的OSF。總之，本研究證實CB具有良好的抗纖維化作用，是一種很有應(yīng)用前景的抗OSF藥物。

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Effect and Mechanism of Calculus Bovis on Areca Nut Extract-induced Oral Submucous Fibrosis in Vitro

ZHU Dan-xia, DAI Jian-ping*, WAN Qian-ying, CHEN Xiao-xuan, WANG Ge-fei, LI Kang-sheng
(Department of Microbiology and Immunology, Shantou University Medical College, Shantou 515041, China)

ObjectiveIn this study, we have investigated the anti-fibrotic activity of calculus bovis on areca nut-induced oral submucous fibrosis (OSF) in vitro.MethodsHydroxyproline assay, gelatin zymography, antioxidant assay, qRT-PCR, ELISA and western blotting were used.ResultsCalculus bovis could inhibit the ANE-induced abnormal growth and collagen accumulation of oral mucosal fibroblasts. Then we studied the underlying mechanism and found that calculus bovis (6.25 and 12.5 μg/mL) could significantly augment the ANE-induced decrease of MMP2 activity, inhibit the ANE-induced expression of Col1A1, Col3A1, TIMP-1 and TIMP-2, the transcription and release of CTGF, TGFβ1, IL-6 and TNFα, the ANE-induced oxidant stress, and the ANE-induced activation of PI3K/AKT, ERK/JNK MAPK and NF-κB signal pathways.ConclusionCalculus bovis possesses excellent anti-fibrotic activity and is a promising drug for OSF.

Calculus bovis; Areca nut; Oral submucous fibrosis; Anti-fibrosis

R739.85

B

1671-8194（2014）16-0001-04

國家自然科學(xué)基金資助項目（81374040，31170852，81001322）

*通訊作者:E-mail: daijpedu2008@163.com