黃酒苦味影響因素分析

邱修柄，成 堅*，肖麗瓊，李勇波

（仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510225）

黃酒以大米、黍米為原料，一般酒精含量為14%vol～20%vol，屬于低度釀造酒。黃酒含有21種氨基酸，其中包括數種未知氨基酸，且8種必需氨基酸黃酒都具備，故被譽為“液體蛋糕”。但是在品評黃酒的過程中，經常遇到酒的“后味”偏苦，針對這個問題，本次試驗通過從釀酒原料、酒曲添加量、酒藥添加量和主發酵溫度4個因素研究對黃酒的苦味影響，以改善黃酒風味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精白糯米、糙白糯米、精黑糯米、糙黑糯米、精白粳米、酒曲、酒藥：梅州市成氏酒業提供；2-辛醇：美國Sigma公司；甲醇、乙腈、乙醇（分析純）：瑞典歐譜生公司；酪醇標品、冰乙酸分析純、NaCl（分析純）、0.5%對二甲胺基苯甲醛一硫酸溶液、混合氨基酸標準品、衍生劑鄰苯二甲醛（o-phenylenediamine，OPA）、氯甲酸芴甲酯（fluorenylmethy chloroformate，FMOC）及硼酸鹽緩沖溶液、磷酸二氫鈉、福林酚試劑甲、乙液、牛血清蛋白（分析純）：廣州化學化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

PHS-25PH計：上海虹益儀器儀表有限公司；LRH-150生化培養箱：韶關市鑫騰科普儀器有限公司；FA1004磁力加熱攪拌器：金壇市富華儀器儀表有限公司；電熱恒溫水浴鍋：廣州市康恒儀器有限公司；YBFJ-110酒精計：河北省故仙粵興玻璃儀表廠；1100型高效液相色譜儀、4.6mm×150mm 5-Micron 氨基酸分析柱、4.6mm×250mm×5μm ZORBAX Eclipse Plus C18柱：美國安捷倫科技有限公司；SZ-93自動雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；721分光光度計：上海精密儀器科學有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃酒加工工藝流程

1.3.2 苦味值的測定

感官評定方法：感官評定小組由5人組成，評定員用蒸餾水漱口之后，取待評定液2mL入口中，10s后吐出，漱口后取與之味道相近之標準液品嘗，如確認兩味近，即可將待評定液的苦味值定為該標準液的苦味值，否則需取其他標準嘗，直至確定苦味值。取5人評定的平均值。標準液：按MOGENSEN L等[1]，的方法配制，以奎寧為基準，經評定a（a=3×10-6mol/L）為下限，剛好沒有苦味；32a為上限，再增加苦味基本上不增加；中間溶液濃度成倍增加，苦味值也相應增加。評分標準如表1所示[2]。

表1 苦味值的評分標準Table 1 Evaluation criteria of bitterness

1.3.3 黃酒中醇酯類的測定[3]

樣品處理：聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）萃取頭使用前先在氣相色譜進樣口275℃活化30min；于50mL容量瓶中加入正辛醇（2.59mg/mL，作為內標）0.4mL，用酒樣稀釋至刻度，再移取5mL酒樣于頂空瓶中，并加入1.5g NaCl，旋緊蓋子密封，將PA萃取頭及頂空瓶在55℃磁力攪拌器上攪拌30min，取出萃取頭，進行GC/MS分析。

GC條件：HP-5MS（30m×0.25mm×0.25mm）毛細管柱。程序升溫：起始溫度為55℃，保留3min，以4℃/min的速度升至140℃，最后以15℃/min的速度升至220℃，后運行10min。進樣口溫度：220℃；GC進樣解吸時間：10min。分流比：10∶1；載氣：He；流量為1mL/min。

MS條件：離子源：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量：70eV；全掃描。檢測器溫度：220℃。

1.3.4 黃酒中雜醇油含量的測定[4]

無雜醇油乙醇制備：取0.1mL按GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛生標準》中操作方法檢查不顯色，如果顯色需進行處理。雜醇油標準溶液：稱取0.080g異戊醇和0.020g異丁醇于100mL容量瓶中，加無雜醇油乙醇50mL，再加水稀釋至刻度，此溶液每毫升相當于1mg雜醇油，置低溫保存。吸取雜醇油標準溶液5.0mL于50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，此溶液每毫升相當于0.1mg雜醇油。

操作步驟：

（1）樣品管及標準管的準備：吸取0.5mL酒樣于10mL比色管中為樣品管，再分別吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.0mL雜醇油標準使用液（相當于0mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.10mg雜醇油）置于10mL比色管中。

（2）分析：分別于樣品管及標準管中各準確加水至1mL，搖勻后放入到冷卻水中沿管壁加2mL對二甲胺基苯甲醛-硫酸溶液，同時搖勻后放入沸水浴中加熱15min后取出，立即放入冰浴中冷卻，立即各加2mL水混勻，冷卻10min后用1cm比色皿以零管調零，于波長520nm處測吸光度值，繪制標準曲線進行定量分析。

1.3.5 黃酒中酪醇的測定[5]

樣品的處理：超聲脫氣過的酒樣直接上樣。

色譜條件：C18柱，柱溫30℃；甲醇-水-冰乙酸（40∶59∶1，v/v）溶液為流動相，流速0.75mL/min，檢測波長280nm，進樣量1～10μL，采用峰面積外標法定量。

標準物質的配制：以體積分數20%的酒精為溶劑，配制酪醇100mg/L標準儲備溶液。將標準儲備溶液分別進樣1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL、3.5μL，以峰面積為橫坐標，標準物質質量濃度為縱坐標，進行線性回歸分析。

1.3.6 黃酒中氨基酸的測定[6-7]

樣品處理：取約10mL的酒樣，離心后，用純水稀釋10倍，用1%的活性炭脫色10s左右，用濾紙過濾后取濾液用0.45μm的濾膜過濾，放入小瓶壓蓋作為供試品，待測游離氨基酸。

氨基酸色譜分析條件：采用柱前OPA、FMOC衍生化，梯度洗脫的方式進行色譜分析；色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6mm×250mm，5μm）。

流動相A：0.04mol/L NaH2PO4緩沖溶液（pH7.8）；流動相B：乙腈∶甲醇∶水（45∶45∶10，v/v）。

洗脫程序：時間T（min）/流動相B（%）：0/0；1.9/0；18.1/57；18.6/100；22.3/100；23.2/0；26/0；檢測波長：338nm（OPA）；262nm（FMOC）；柱溫：40℃；流速：2mL/min。

1.3.7 黃酒中苦味肽的測定[7-8]

樣品處理：各取酒樣50mL加入50mg單寧酸，攪拌30min后靜置過濾，棄去初濾液5mL，吸取30mL濾液加入30mL異丁醇萃取10min，靜置吸取醇相1mL于50mL容量瓶中定容。此液為樣品稀釋液。

福林酚試劑甲：將溶液A 50mL和溶液B 1mL混合即成，現用現配。

溶液A：1g Na2CO3溶于50mL的0.1mol/L NaOH溶液中。

溶液B：將1%硫酸溶液和20g/L酒石酸鉀鈉溶液等體積混合而成。

牛血清蛋白：精確稱取牛血清蛋白，配制成100μg/mL溶液。

分析步驟：吸取樣品稀釋液1mL，加入試劑甲3mL，置于25℃中水浴保溫10min，再加入試劑乙0.3mL，立即混勻、保溫30min，以介質溶液調零，測定A750nm值，與蛋白質標準液作對照，求出樣品的苦味肽含量。

2 結果及分析

2.1 原料對苦味的影響

以糙白糯米、糙黑糯米、精白糯米、精黑糯米為原料生產酒基測定其苦味值及苦味成分。從表2可知，糙米的高級醇、苦味氨基酸以及苦味肽、糠醛的含量都稍高精白后的米，而黑糯米的苦味物質又稍高于白糯米的苦味物質。由于精白米脫去了果皮種皮糊粉層，所以蛋白質含量低于糙米，蛋白質含量高，發酵生成的氨基酸、高級醇含量就高，具苦味的氨基酸含量也增加。且糙米米皮中的半纖維素、多縮戊糖在發酵和殺菌受熱生成糠醛等物質，使酒具苦澀味。因此以糙米為原料的黃酒其苦味物質普遍多于精米所釀黃酒。黑糯米的蛋白質含量比普通早秈米的蛋白質含量高10.4%，比普通的晚秈米高22.1%[10]。因此黑糯米中的苦味物質較白糯米高，黑糯米中的強心苷、生物堿、植物甾醇等多種生理活性物質都是具有苦味的物質，所以其苦味值較白糯米高，但其營養價值較白糯米高。原料蛋白質含量的控制，能夠降低黃酒的苦味值，因此適當提高米的精白度，并除去米糠、麥桿、麥殼等雜質能降低其苦味值[9]。

表2 不同原料黃酒苦味成分表Table 2 Bitter ingredients in different rice wine

2.2 酒曲用量對苦味的影響

從表3可以看出，當酒曲添加量較大時，酒曲中酸性蛋白酶和酸性羧（基）肽酶數量較多，主發酵時生成氨基酸、高級醇數量多且各種霉菌孢子后期大量自溶入酒內，霉菌孢子給酒產生強烈苦味，給黃酒帶來較重苦味；當酒曲添加量較少時此2種酶數量少，則酵母繁殖緩慢，發酵不正常，酵母繁殖缺少營養將導致細胞提早自溶，產生苦味氨基酸，苦味肽含量將偏高，影響黃酒風味和穩定性。另外隨著酒曲用量的增加苦味肽含量略有減少，其原因是酒曲中能分解肽的酶有所增加[10-11]。

表3 不同酒曲量黃酒苦味成分Table 3 Bitter ingredients rice wine with different koji addition

2.3 主發酵溫度對苦味的影響

主發酵溫度較高，則酵母的繁殖倍數增加，酵母發酵過程中能將更多的氨基酸轉換成高級醇。而且溫度適當的提高能使發酵過程中產生的酶的活力提高，從而將更多的氨基酸轉換成高級醇。從表4可以看出，隨著發酵溫度的升高，苦味肽含量略有降低[12-13]。

表4 不同主發酵溫度黃酒苦味成分表Table 4 Bitter ingredients of rice wine with different fermentation temperature

2.4 工藝優化[14-16]

以酒藥添加量、酒曲添加量、主發酵溫度為因素，苦味值為考察指標設計3因素3水平的正交試驗，因素水平見表5，結果見表6，方差分析見表7。

表5 黃酒發酵條件正交試驗因素水平Table 5 Factors and levels of orthogonal test for optimization of rice wine fermentation conditions

表6 黃酒發酵條件正交試驗結果Table 6 Results and analysis of orthogonal test for optimization of rice wine fermentation conditions

表7 黃酒發酵條件正交試驗方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal test for optimization of rice wine fermentation conditions

由表7可得，各因素指標的極差均大于空列的極差，所以A、B、C各因素的效應都存在。由方差分析可看出，各因素均沒有顯著性影響。其原因可能是由于試驗主觀因素較大，且因素的自由度都較小，使檢驗的靈敏度降低，從而掩蓋了考察因素的顯著性判斷。但仍然可以看出，各因素對黃酒苦味影響的大小依次為C＞B＞A。因此按照各因素的最好水平選取出最好的水平組合為C2B2A2，即主發酵溫度均為30℃；酒曲添加量為10%，酒藥添加量為0.8%。在此最佳發酵工藝條件下進行3次驗證試驗，成品苦味值評分平均值為2.3。

3 小結與討論

3.1 糙米的高級醇，苦味氨基酸以及苦味肽的含量都稍高精白米，而黑糯米的苦味物質又稍高于白糯的苦味物質。

3.2 隨著酒藥用量的增加高級醇含量先減少再增加，而苦味氨基酸則先增加后減少。

3.3 當酒曲添加量較大時，主發酵時生成氨基酸、高級醇數量則多；當酒曲添加量較少時此兩種酶數量少，產生苦味氨基酸，苦味肽含量將偏高。

3.4 主發酵溫度較高，酵母發酵過程中能將更多的氨基酸轉換成高級醇；隨著發酵溫度的升高，苦味肽含量略有降低。

3.5 酒藥添加量、酒曲添加量、主發酵溫度各因素的效應都存在。各因素對黃酒苦味影響的大小依次為主發酵溫度＞酒曲添加量＞酒藥添加量。最好的水平組合為主發酵溫度30℃；酒曲添加量10%，酒藥添加量0.8%。

[1]MOGENSEN L,ADLER-NISSEN J.Evaluating bitterness masking principles by taste panel studies[C].Frontiers of Flaver Proceeding of the 5th International Flavor Conference Porto Karras,Chalkidiki,1987.

[2]唐慧敏，任 麒，沈慧鳳.苦味評價方法的國內外研究進展[J].中國新藥雜志，2009，18（2）：127-131.

[3]殷德榮.毛細管氣相色譜法測定紹興黃酒中揮發性物質[J].中國衛生檢驗雜志，2006，16（8）：929-931.

[4]高 敏，曾新安，于淑娟.荔枝酒中雜醇油含量的測定[J].食品工業科技，2010（5）：356-358

[5]FRIíAS S,CONDE J E,RODRI?GUEZ-BENCOMO J J,et al.Classification of commercial wines from the Canary Islands (Spain) by chemometric techniques using metallic contents[J].Talanta,2003,59(2):335-344.

[6]王 娟，繆震元，吳岳林，等.高效液相色譜分析對羥基苯乙醇含量[J].精細化工中間體，2003，33（6）：58-59.

[7]鐘其頂，高紅波.PITC 柱前衍生高效液相色譜法測定黃酒中17 種氨基酸方法研究[J].釀酒，2010，37（5）：74-76.

[8]武彥文，歐陽杰.氨基酸和肽在食品中的呈味作用[J].中國調味品，2001（1）：21-24.

[9]孟中法，謝廣發.重視黃酒肽類物質的研究[J].釀酒科技，2004（3）：77-78.

[10]夏艷秋.優質黃酒菌種、原料及發酵工業的研究[D].江蘇：揚州大學碩士論文，2004.

[11]方 華.紹興黃酒麥曲中微生物的初步研究[D].無錫：江南大學碩士論文，2006.

[12]壽泉洪.淺論溫度對黃酒生產的影響[J].釀酒，2003，30（3）：47-49.

[13]權美平.黃酒的生產工藝及其穩定性的研究[D].西安：陜西師范大學碩士論文，2005.

[14]顧國賢.釀造酒工藝學[M].北京：中國輕工業出版社，1996.

[15]孫俊良.糯米酒最佳發酵工藝條件的研究[J].釀酒，1998（2）：54-55.

[16]徐呈祥.黃酒釀造新工藝新技術研究[J].釀酒，1993（6）：27-29.