一種喹諾酮類藥物的酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒的研制

鄭百芹，羅曉琴 *，馮才偉，董李學，賈芳芳，蒙君麗，郝立武，張書宏

（1.唐山市畜牧水產品質量監(jiān)測中心，河北 唐山 063000；2.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206）

喹諾酮類藥物是一類全合成的抗菌藥物[1-2]，具有抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透能力強等優(yōu)點，已成為水產養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一[3-4]。隨著我國水產品養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，近年來水污染影響嚴重，水產病害時有發(fā)生，因此，漁用獸藥用量越來越頻繁，導致了藥物殘留超標問題。中國、日本、歐盟均對喹諾酮類藥物制定了最大允許限量，美國等一些國家未允許用于水產養(yǎng)殖業(yè)[5]。因此，研究對喹諾酮類藥物的檢測方法有著重要意義。

喹諾酮類藥物殘留的檢測手段有常規(guī)儀器法和快速檢測法。常規(guī)儀器法有高效液相色譜法、氣相色譜法、色質聯(lián)用等技術，快速檢測法有酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法等[6-13]。本實驗研究了水產品中氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星等3種喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫吸附法。該方法的準確性高于一般的快速檢測方法，檢測程序及所需條件較儀器法更方便，尤其便于現場大量樣本的檢測，更適于中小企業(yè)對成本控制的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星標準品：北京標準物質研究中心；乙腈：北京百欣試劑公司；魚肉：市售；包被原、氧氟沙星單克隆抗體、酶標二抗：北京勤邦生物技術有限公司。

0.1mol/L氫氧化鈉溶液：實驗室自制；抗原稀釋液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）；復溶液（0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）；洗滌液（向0.02mol/L PBS中加入1%吐溫）；封閉液（在0.02mol/L PBS中加入0.05%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）；底物顯色液由A液和B液組成，A液為過氧化氫，B液為四甲基聯(lián)苯胺；終止液（2mol/L H2SO4）。以上實驗用化學試劑：北京百欣試劑公司。

1.2 儀器與設備

MK3酶標儀（最大量程為4.0）：上海雷勃分析儀器有限公司；MX-F渦旋儀：湖南湘立科學儀器有限公司；HFJ-10均質器：湖南湘立科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 最佳抗原包被濃度、單克隆抗體濃度的確定

以棋盤法確定最佳抗原包被濃度，氧氟沙星標準品質量濃度分別為0，0.2μg/L，抗原液稀釋倍數：2 000、6 000、18 000；單克隆抗體液稀釋倍數：10 000、30 000、90 000、270 000；根據實驗室前期已有基礎，選擇的酶標二抗液稀釋倍數為1 000。

1.3.2 喹諾酮類藥物試劑盒的制備

以100μL適宜稀釋倍數的抗原稀釋液包被96孔酶標板，37℃孵育2h，然后用洗滌液洗板3次，拍干，用150μL封閉液封閉，37℃孵育2h，取板后拍干即可。

1.3.3 喹諾酮類藥物試劑盒配套試劑

96孔酶標板，標準品1～6（質量濃度分別為0、0.2μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L），高質量濃度標準品（質量濃度為1mg/L），酶標二抗，抗體工作液（即以最佳稀釋濃度稀釋的單克隆抗體），底物液A液，底物液B液，終止液，20×濃縮洗滌液，5×濃縮復溶液。

1.3.4 樣本前處理方法

研究以魚肉為樣本，稱取2.0g均質后的魚肉樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，分別加入1mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液和7mL乙腈，用振蕩器振蕩5min，3 000r/min 以上，室溫（20～25℃）離心10min；移取2mL上清液至10mL潔凈干燥玻璃試管中于50～60℃水浴氮氣流下吹干；加入1mL 正已烷用渦旋儀渦動30s，再加入1mL復溶工作液，渦動30s，3 000r/min以上，室溫（20～25℃）離心5min；除去上層有機相，取下層水相50μL用于分析。

1.3.5 操作步驟

加標準品/樣本50μL 到對應的微孔中，然后加入酶標二抗50μL/孔，再加入抗體工作液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應30min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10s，潑掉板孔內洗滌液，用吸水紙拍干。加入底物液A液50μL/孔，再加入底物液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應15min。加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處，測定每孔OD450nm值。

1.3.6 結果判定方法

標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的平均吸光度值（雙孔）除以第一個標準品（0標準）的平均吸光度值，再乘以100%，即：

式中：B 為一定質量濃度標準品或樣本溶液的平均吸光度值；B0為0μg/L 標準溶液的平均吸光度值。

1.3.7 ELISA方法測定標準曲線的建立

以標準品百分吸光率為縱坐標，以喹諾酮類藥物標準品質量濃度（μg/L）的對數為橫坐標，繪制酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）標準曲線。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的質量濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中喹諾酮類藥物的實際質量濃度。

1.3.8 喹諾酮類藥物試劑盒的鑒定

根據上述實驗，參照其操作步驟，分別加入最適量抗原、單抗和酶標二抗，氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星標準品質量濃度分別以0、0.2μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L加入，測定標準曲線。

1.3.9 試劑盒靈敏度和檢測限試驗

對20份魚肉空白樣品進行檢測，從標準曲線上查出對應于各吸光度值的質量濃度，以20份樣本質量濃度的平均值加上3倍標準差表示方法檢測限（method detection limit，MDL）。

1.3.10 樣本精密度和準確度試驗

以回收率作為方法準確度評價指標，重復測定某一質量濃度樣品的檢測結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）作為方法精密度評價指標。

分別按0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L 3個質量濃度的喹諾酮類藥物對魚肉樣品進行添加回收試驗，每個樣品做3個平行，用3批不同試劑進行測定。

1.3.11 穩(wěn)定性試驗

將試劑盒存放在4℃條件下，連續(xù)12個月，每個月測定一次；將試劑盒存放在37℃條件下，放置7d進行測定。以上測定指標均為試劑盒的最大吸光度值（零標準）、50%抑制濃度（half-inhibitory concentration，IC50）以及按0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L 3個質量濃度的喹諾酮類藥物對魚肉樣品進行添加回收試驗所測得的回收率，直到試劑盒的靈敏度和回收率開始下降為止，根據試驗結果判斷試劑盒的穩(wěn)定性。

由于考慮到在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現，因此將試劑盒在37℃保存條件下放置7d，測定試劑盒的各項指標是否符合要求。

1.3.12 交叉反應率試驗

選擇與氧氟沙星具有類似結構的藥物環(huán)丙沙星、氨氟沙星進行酶聯(lián)免疫吸附測定，通過ELISA標準曲線分別得到其50%抑制濃度，用下式計算試劑盒對其他藥物的交叉反應率：

2 結果與分析

2.1 最佳抗原包被質量濃度、單克隆抗體質量濃度的確定

測定質量濃度為0和0.2μg/L的氧氟沙星標準品的光密度值OD450nm，結果見表1。

試劑盒的最大光密度值（零標準）范圍應在1.5～2.2，當OD450nm（0.2μg/L）/OD450nm（0）的抑制率在70%～85%時，選擇抗原的最大稀釋倍數作為抗原效價，即抗原稀釋倍數為18 000，單克隆抗體液稀釋倍數為9 000。

表1 抗原效價篩選Table 1 Detection of the suitable dilution time of antigen

2.2 喹諾酮類藥物試劑盒的鑒定

ELISA方法測定氧氟沙星標準曲線見圖1，喹諾酮類藥物ELISA相關參數見表2。

圖1 氧氟沙星標準曲線Fig.1 Standard curve of ofloxacin

表2 喹諾酮類藥物ELISA相關參數Table 2 ELISA related parameters of quinolones

由表2可知，標準曲線回歸方程相關系數R2≥0.99，說明方程線性良好。IC50值較小，說明試劑盒的靈敏度較好。氧氟沙星、環(huán)丙沙星和氨氟沙星的檢測限均為1μg/kg。

2.3 樣本精密度和準確度試驗

以0.5μg/kg、1.0μg/kg、2.0μg/kg 3個質量濃度的氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星分別對魚肉樣品進行添加，檢測結果見表3。

由表3可知，平均回收率在62.8%～97.7%之間，說明方法準確性較高；批內、批間相對標準偏差均小于10%，說明方法精密度較好。由于經高效液相色譜法測定添加回收實驗的魚肉樣品的喹諾酮類藥物含量均在0.19μg/L以下，因此視為魚肉中喹諾酮類藥物含量為0。

表3 魚肉精密度及準確度試驗Table 3 Precision and accuracy tests of fish sample

2.4 穩(wěn)定性試驗

將試劑盒分別在4℃條件下放置12個月、37℃條件下放置7d，經過測定，試劑盒的最大光密度值（零標準）（1.5～2.2）、50%抑制濃度（0.6～1.8μg/L）、喹諾酮類藥物添加回收率（60%～100%）均在正常范圍之內。

2.5 交叉反應率試驗

氧氟沙星抗體與其他喹諾酮類藥物的交叉反應率見表4。

表4 氧氟沙星抗體與其他喹諾酮類藥物交叉反應率試驗Table 4 Cross reaction rate test of ofloxacin antibodies and other quinolones

由表4可知，氧氟沙星抗體與環(huán)丙沙星、氨氟沙星的交叉反應率為100%，說明該抗體能夠用于檢測氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星3種喹諾酮藥物，為研制可以同時檢測多種喹諾酮類藥物的ELISA試劑盒提供了可能。

3 結論與討論

我國國家標準GB/T20366—2006《動物源產品中喹諾酮類殘留量的測定》利用液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測喹諾酮類藥物殘留量，該種方法的優(yōu)點是準確，缺點是所需儀器昂貴，需要專業(yè)的操作人員和較長的時間。因此，利用酶聯(lián)免疫試劑盒能夠比國標方法更加快速、簡便地檢測出魚肉樣本中的喹諾酮類藥物含量，而該試劑盒的操作時間僅需45min，適合現場大量檢測樣本的檢測。

本實驗在已有的技術平臺上，對影響喹諾酮類藥物ELISA試劑盒的各個條件進行了研究，并確定了最佳的抗原液濃度和單克隆抗體濃度。通過一系列實驗，確定了該試劑盒對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星的檢測限均為1μg/kg，平均回收率為62.8%～97.7%，說明方法準確性較高；批內、批間相對標準偏差均小于10%，說明方法精密度較好。

SN/T 1751.1—2006《動物源性食品中喹諾酮類藥物殘留檢測方法》的第一部分使用的方法是微生物抑制法。微生物法靈敏度高、結果準確，但也有許多局限性，如整個實驗周期長，批次間檢測結果重復性差，檢測結果受樣品中所含抗喹諾酮類藥物或抗生素成分的影響等。由于某些不可避免的人為誤差，不同批次的ELISA試劑盒在制作過程中很難保證質量完全一致，而本實驗研制的喹諾酮類藥物檢測試劑盒的批內、批間相對標準偏差均小于10%，重現性較好。

由于酶聯(lián)免疫試劑盒的試劑（尤其是酶）會受到溫度的影響，保存溫度的過高或過低都會對其質量產生影響，因此穩(wěn)定性測試是評價試劑盒質量的一個重要方面[14-15]。本實驗通過分析該試劑盒在不同溫度下的保存時間，結果表明，當試劑盒在4℃條件下保存12個月，在37℃條件下保存7d，測定的最大光密度值（零標準）、50%抑制濃度、喹諾酮類藥物添加回收率均在正常范圍之內，驗證了該試劑盒具有良好的穩(wěn)定性。

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