女貞子對MPP+誘導的PC12細胞氧化應激損傷保護作用研究

徐希娟，楊中林

(中國藥科大學 天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，江蘇 南京 210009)

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女貞子對MPP+誘導的PC12細胞氧化應激損傷保護作用研究

徐希娟，楊中林*

(中國藥科大學 天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，江蘇 南京 210009)

目的：探討女貞子是否對MPP+誘導的PC12細胞氧化應激損傷具有保護作用。方法：采用MPP+誘導的PC12細胞作為帕金森病體外模型，同時給予不同濃度的女貞子醇提液、水提液。通過MTT法測定細胞存活率，通過超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)及乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒來檢測女貞子對細胞氧化應激損傷的影響。結果：與正常組相比，模型組細胞的細胞存活率顯著下降，SOD抑制率、NO含量、MDA含量及LDH水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，濃度為1mg/mL的女貞子水提液顯著提高細胞存活率，顯著降低SOD抑制率、NO含量、MDA含量及LDH水平。結論：女貞子水提液對細胞的氧化應激損傷具有一定的保護作用。

女貞子；PC12細胞；MPP+；氧化應激損傷

帕金森病(Parkinson disease，PD)是指通過病史或客觀檢查找不出能夠解釋那些臨床癥狀原因的疾病，其癥狀和體征通常是兩側不對稱的，同時對多巴胺治療有效，也稱原發性帕金森病[1]。近年來研究證明，中腦黑質部位氧化應激反應增強及抗氧化保護機制減弱可能是引起發病的重要機制之一[2]。女貞子提取液能明顯地改善D-半乳糖引起的衰老小鼠學習和記憶能力，具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、減少氧化脂質生成的作用[3]。而氧化應激在帕金森病的發病機制中起著重要的作用，故推測女貞子對抗帕金森病具有一定的作用。本實驗以MPP+誘導的PC12細胞為模型，探索女貞子對其是否具有保護作用，為其應用于帕金森病的防治提供依據。

1 材料與試藥

1.1 實驗儀器

Forma311系列直熱式CO2培養箱(Thermo Electron Corporation，USA)，超凈工作臺(蘇州艾可林凈化設備有限公司)，COIC XDS-1B型倒置光學顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)，Synergy2型酶標儀(Biotek公司)，TGL-16型高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司)，YXQ-SG41-280型電熱提壓力蒸汽消毒器(上海醫用核子儀器廠)，TB-25型十萬分之一電子天平(Sartorius，USA)。

1.2 細胞株

PC12細胞，中國醫學科學院基礎醫學研究所惠贈。

1.3 藥物與試劑

女貞子藥材(購于江蘇省南京市先聲再康藥業，經本人鑒定為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實)，MPP+iodide(Sigma公司，產品編號81512)，DMEM高糖培養基(GBICO，批號1031719)，四季青胎牛血清(四季青公司，批號110419)，胰蛋白酶(GIBCO，批號27250018)，二甲基亞砜(南京化學試劑有限公司，批號P1059733)，Western 及IP細胞裂解液(碧云天生物技術研究所，批號P0013)。

1.4 試劑盒

SOD試劑盒(南京建成生物技術有限公司，批號20130928)；MDA劑盒(南京建成生物技術有限公司，批號20130925)；LDH試劑盒(南京建成生物技術有限公司，批號20131008)；NO試劑盒(南京建成生物技術有限公司，批號20130930)。

2 實驗方法

2.1 樣品液及試劑配制

2.1.1 樣品液的制備 取女貞子藥材10g，加10倍量水浸泡2h，10、9、8倍量蒸餾水直火煎煮3次，分別煎煮2.5、2.0、1.5h，合并提取液，濃縮，減壓干燥后得水提物。取女貞子藥材10g，加10倍量70%的乙醇浸泡2h，10、9、8倍量70%的乙醇85℃回流3次，分別回流2.5、2.0、1.5h，合并提取液，回收乙醇，減壓干燥后得醇提物。稱取上述兩種提取物適量，給藥前用DMEM高糖培養基制成濃度分別為1、0.1、0.01mg/mL的樣品溶液。

2.1.2 MPP+溶液的配制 稱取一定量MPP+iodide，加入10mL的DMEM高糖培養基，渦旋溶解，得濃度為20mmol/L的MPP+母液，用無菌濾膜過濾，置冰箱內-20℃保存，備用。

2.1.3 普拉克索溶液的配制 精密稱取一定量普拉克索粉末，用DMEM高糖培養基溶解，得濃度為1×10-2mol/L的母液，用無菌濾膜過濾，置冰箱內保存，備用，使用時用培養液稀釋到相應的濃度。

2.2 細胞培養

采用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，在5%CO2、37℃恒溫恒濕培養箱中培養，每3～4天傳代1次。

2.3 細胞活性的測定

將PC12細胞以3×104cell/mL的密度接種于96孔板，每孔200μL，培養24h后給藥。實驗組分別加入濃度為1、0.1、0.01mg生藥/mL的水提物與70%醇提物，陽性藥組加入等體積終濃度為1×10-7mol/L的普拉克索，空白對照組加入等體積的DMEM高糖培養基；除空白組，每組加入終濃度為2mmol/L的MPP+溶液；每組均設6個復孔。繼續培養44h，每孔加入濃度為5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃孵化4h，有藍紫色沉淀生成。吸去培養液，每孔加入150μL/孔DMSO溶解，振蕩搖勻10min，置酶標儀上570nm處測各孔光吸收值OD。

2.4 氧化應激水平測定

將PC12細胞以5×104cell/mL密度接種于24孔培養板，每孔1mL，培養24h后給藥。實驗組分別加入濃度為1mg生藥/mL的水提物與70%醇提物，陽性藥組加入等體積終濃度為1×10-7mol/L的普拉克索溶液，空白對照組加入等體積的不含血清的DMEM高糖培養基；除空白組，每組加入終濃度為2mmol/L的MPP+溶液；每組均設3個復孔，繼續培養48h。細胞培養48h后，將板取出，從各孔中精密吸取培養液，按照NO、LDH試劑盒進行檢測。細胞上清取完之后，棄去剩余培養液，用4℃預冷的PBS洗滌2次，加入裂解液100μL，在冰上裂解30min，收集裂解液，按SOD、MDA試劑盒分別進行測定。

2.5 統計學分析

3 實驗結果

3.1 細胞活性測定

由表1可知，經MPP+誘導后細胞存活率極顯著降低，說明造模成功。1mg/mL的水提物與70%乙醇提取物明顯能提高細胞活性，細胞存活率顯著高于模型組(P<0.05)，其它各濃度的女貞子提取物對PC12細胞的活性無顯著保護作用。陽性藥組細胞存活率低于女貞子組，說明1mg/mL的水提物與70%乙醇提取物能提高PC12細胞活性，且作用優于陽性藥普拉克索。

3.2 氧化應激水平測定

由表2可知，模型組各指標與正常組相比具有顯著性差異，說明造模成功。1mg/mL的女貞子水提物能顯著性減小SOD抑制率，降低MDA、NO與LDH含量及水平，70%乙醇提取物只能顯著性降低MDA含量。陽性藥組只有MDA與NO顯著降低。實驗結果說明1mg/mL的女貞子水提物能夠抗氧化應激，且其作用優于陽性藥普拉克索。

表1 女貞子各提取物對PC12細胞存活率的影響 (n=6)

Contrast to model group，*P<0.05；**P<0.01;Contrast to normal group，▲P<0.05；▲▲P<0.01。

表2 女貞子對氧化應激水平的影響 (n=3)

Contrast to model group，*P<0.05；**P<0.01。Contrast to normal group，▲P<0.05；▲▲P<0.01。

4 討論

PC12細胞來自于Rattus norvegicus(褐家鼠)腎上腺嗜鉻細胞瘤(一種交感神經系統的腫瘤) ，經NGF誘導分化后，所合成的酶類、表達的受體以及合成的神經遞質很接近中腦DA能神經元[4-5]。因此PC12細胞被廣泛用作DA能神經元體外研究，特別是用于神經變性病如PD發病機制和藥物作用機制的研究。MPTP對中腦黑質多巴胺神經元有選擇性破壞作用[6]，MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶離子)是MPTP的活性代謝產物，是線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的抑制劑，可導致線粒體ATP 的缺失和膜電位的喪失，從而誘導PC12細胞線粒體功能障礙和氧自由基生成增加，造成多巴胺神經元損傷[7]。研究表明，氧化應激損傷導致一些氧化損傷標記物質明顯增多，如MDA[8]。MDA和LDH含量增高，說明多巴胺能神經細胞損傷程度升高。SOD活性降低，導致自由基量增多。自由基另一個來源為大腦黑質病變，一氧化氮合成酶表達增加，從而導致一氧化氮(NO)和過氧硝酸鹽自由基水平升高，進而導致多巴胺能神經細胞受損。

本實驗采用將女貞子提取物、MPP+與PC12細胞共同培養的方法，考察不同提取物對PC12細胞的細胞活性及氧化應激作用的影響。實驗結果表明女貞子水提物及70%醇提物均能顯著性提高細胞存活率，且其作用與濃度有密切關系。另外，女貞子水提物能夠顯著降低SOD抑制率，減少MDA、NO及LDH含量，說明其具有抗氧化應激作用。由此推斷，女貞子抗PD作用可能是通過抗氧化應激而實現的。

[1] 蔣雨平，王堅，丁正同，等.原發性帕金森病的診斷標準 (2005 年)[J]. 中國臨床神經科學，2006，14(1)：40.

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[3] 張振明，蔡曦光，葛斌，等.女貞子多糖的抗氧化活性研究[J].中國藥師， 2005，8(6)：489-491.

[4] 張廣獻 ，祝其鋒. NGF 誘導 PC12 細胞分化的研究[J].生物學雜志，2002，19(4)：14-15.

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[6] J W LANGSTON，P BALLARSD，J W TRTRUD，et al.Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis[J]. Science，1983，219(4587)：979-980.

[7] J LOTHARIUS，K LO'MALLEY.The Parkinsonism-inducing Drug 1-Methyl-4-phenylpyridinium Triggers Intracellular Dopamine Oxidation A NOVEL MECHANISM OF TOXICITY[J]. Journal of Biological Chemistry， 2000，275(49)：38581-38588.

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(責任編輯：姜付平)

Effect of Fructus Ligustri Lucidi on oxidative stress induced by MPP+in PC12 cells

Xu Xijuan，Yang Zhonglin*

(China Pharmaceutical University,State Key laboratory of Natural Products and Functions,Nanjing 210009,China)

Objective:To evaluate the effect of Fructus Ligustri Lucidi on oxidative stress in vitro. Methods:PC12 cells induced by MPP+was used as the vitro model of parkinson disease,while adding 70% ethanol extract and aqueous extract of Fructus Ligustri Lucidi of different concentrations. Cell vibility was determined by MTT methods.Effect of Fructus Ligustri Lucidi on oxidative stress was tested by kits of SOD,NO,MDA and LDH.Results:Contrast to normal group,cell viability of model group dropped significantly,and inhibition rate of SOD, content of MDA, content of NO and level of LDH of model group significantly raised.Compared with model group, aqueous extract of Fructus Ligustri Lucidi of 1mg/mL increased the cell vibility markedly,and lowered inhibition rate of SOD, content of MDA, content of NO and level of LDH significantly.Conclusion:It implys that aqueous extract of Fructus Ligustri Lucidi can protect PC12 cells from oxidative stress damage.

Fructus Ligustri Lucidi;PC12 Cells; MPP+;oxidative stress damage.

2014-03-11

徐希娟(1989-)，女，中國藥科大學碩士研究生，研究方向為中藥制劑學。

楊中林(1950-)，女，中國藥科大學教授，博士生導師，研究方向為中藥炮制與中藥制劑。

R285

A

1673-2197(2014)11-0006-03