UPLC-MS/MS檢測降血脂類保健食品中違法添加物

郝剛 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇蘇州 215104）

UPLC-MS/MS檢測降血脂類保健食品中違法添加物

郝剛 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇蘇州 215104）

目的：建立專屬、靈敏的超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）用于快速定性定量檢測降血脂類保健食品中3種違法添加化學成分。方法：供試品經甲醇提取后，采用UPLC-MS/MS，以BEH-C18為分析柱，流動相采用含20 mmol/L乙酸銨的水溶液和甲醇進行等度洗脫，采用電噴霧電離、子離子掃描（Daughter Scan）及多重反應監測（MRM）模式對保健食品中違法添加的煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀3種化學成分進行快速定性定量檢測。結果：所建立方法可在1 min內快速定性定量檢測保健食品中3種違法添加化學藥物，且線性關系良好，平均加樣回收率在95.4%～98.8%，方法檢出限為0.5～12.5 μg/g。結論：該方法快速、靈敏、專屬性強，適用于降血脂類保健食品中違法添加化學藥物的快速定性定量檢測。

超高效液相-串聯質譜法；多重反應監測；降血脂類保健食品；違法添加物

WORDSUPLC-MS/MS；MRM；Lipid Lowering Health Foods；Illegal Additives

近年來，伴隨高血脂發病率的逐年上升，降血脂類中成藥和保健食品等健康產品的市場銷量不斷上升[1]。一些不法企業為牟取暴利，在產品中添加具有降血脂功效的化學治療藥物，不僅嚴重影響了降血脂類健康產品的行業發展，也給廣大人民的飲食用藥安全帶了嚴重危害[2]。原國家食品藥品監督管理局于2010年頒布了煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀等3種輔助降血脂類保健食品違法添加藥物的檢測方法，但該方法檢測時間長（進樣時間為36 min），且靈敏度低[3]。本實驗基于超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS），采用多重反應監測（MRM）模式，建立了同時定性、定量檢測降煙酸、辛伐他汀、洛伐他等違法添加藥物的分析方法，為降血脂類保健食品的安全監控提供可靠的技術保障。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITY UPLC Xevo TQ-S三重四級桿液質聯用儀（美國Waters公司）；電噴霧離子源（ESI），Masslynx 4.1數據處理系統（Waters）；Thermo低溫離心機；KQ-300DA型數控型超聲波清洗器；MILLIPORE純水儀。

1.2 樣品與試劑

煙酸對照品（批號：201102，含量99.9%）、辛伐他汀對照品（批號：100601-201003，含量99.0%）、洛伐他汀對照品（批號：100600-201003，含量99.4%）均購于中國食品藥品檢定研究院；實驗用水為超純水，其他試劑均為色譜純。實驗所用樣品均為當地食品藥品監督管理局抽樣樣品。

1.3 色譜條件

色譜柱：BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：A（含20 mmol/L乙酸銨的水溶液）：B（甲醇）=20:80（v/v），流速0.3 mL/min。色譜柱溫度：25℃；進樣盤溫度：4℃；進樣量：1 μL。

（7）Marriage,Divorce and Quasi-rents:Or,I Gave Him the Best Years of My Life(結婚、離婚與準用；或“青春年華付與君”)

1.4 質譜條件

ESI；正離子掃描；毛細管電壓4.0 kV；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣體流量：800 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；碰撞氣體為氬氣；子離子掃描及MRM模式同時監測。

1.5 對照品溶液

分別精密稱取煙酸約50 mg，辛伐他汀、洛伐他汀約10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，作為煙酸（500 μg/mL）、辛伐他?。?00 μg/mL）、洛伐他汀（100 μg/mL）對照品儲備液。將上述3種對照品儲備液各量取10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，作為混合對照品儲備液。

1.6 樣品制備

樣品研細后，精密稱取細粉1.0 g置于50 mL量瓶中，加甲醇約20 mL，超聲15 min，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，13 000 r/m離心10 min，取上清液稀釋500倍，13 000 r/m離心10 min，0.22 μm濾膜過濾，取上清液1 μL進樣分析。

2 實驗結果

2.1 質譜條件優化

分別將3種對照品儲備液用甲醇稀釋成500 ng/mL的對照溶液，選用ESI（＋）離子化模式，通過直接進樣法，進行質譜條件優化。首先，采用一級質譜掃描方式得到各化合物準分子離子峰，在確定準分子離子的基礎上，進行錐孔電壓的優化，得到各化合物的最佳錐孔電壓。再通過子離子掃描模式，對各種化合物的分子離子進行二級碎片離子掃描，每種化合物選擇2個特征碎片離子作為檢測離子，用于化合物定性判斷的依據，實驗結果如圖1所示。各化合物的分子離子及特征碎片離子分別為：煙酸（m/z）：124＞106，80；辛伐他?。╩/z）：419＞285,199；洛伐他?。╩/z）：405＞285，199。

實驗中同時確定各化合物的最佳碰撞能量，并采用MRM掃描模式對各化合物的檢測離子進行掃描，其中響應較高的離子對作為定量離子對。各化合物質譜條件優化結果如表1所示。

2.2 方法專屬性

精密量取煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀對照品儲備液各1 mL至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，作為混合對照品溶液，取1 μL進樣分析，MRM離子流色譜圖如圖2（A）所示，煙酸、洛伐他汀、辛伐他汀保留時間分別為0.44，0.81，0.89 min。

取空白樣品（經檢測不含違法添加成分的降血脂類保健食品），按“1.6樣品制備”方法處理后進樣分析，實驗結果如圖2（B）所示，空白生物樣品MRM離子流色譜圖在0～2 min內無干擾。

圖1 子離子質譜

表1 MRM分析的質譜條件

取空白樣品溶液，加入1 mL混合對照品溶液，再按“1.6樣品制備”方法處理后進樣分析，MRM離子流色譜圖如圖2（C）所示，空白樣品對3種化合物的保留時間無影響，所建方法專屬性良好。

2.3 線性范圍

精密量取煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀對照品儲備液各1 mL至50 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，作為混合對照品溶液，再用甲醇逐級稀釋成不同濃度的混合對照品系列溶液。其中，煙酸濃度為：1 000，500，200，100，50，10，5 ng/mL；辛伐他汀與洛伐他汀的濃度為：200，100，40，20，10，2，1 ng/mL，取系列溶液中不同濃度混合對照品溶液1 μL進樣分析，以峰面積為縱坐標（Y），各對照品濃度為橫坐標（X）進行回歸，結果如表2所示，煙酸在5.0～1 000.0 ng/mL濃度范圍內線性良好，辛伐他汀與洛伐他汀在1.0～200.0 ng/mL濃度范圍內線性良好。

圖2 MRM離子流色譜

表2 線性范圍實驗結果

2.4 檢出限

分別取3種化合物的對照品儲備液，用甲醇逐級稀釋到一定濃度，以信噪比（S/N）大于3為儀器檢出限，結果如圖3所示，煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀的儀器檢出限分別為：0.5，0.05和0.02 ng/mL。

根據儀器檢出限及“1.6樣品制備”項的稀釋倍數，空白樣品中加入對照品溶液，經處理后進樣分析，以S/N等于3，測得方法檢出限分別為：煙酸12.5 μg/g，洛伐他汀1.25 μg/g，辛伐他汀0.5 μg/g。

圖3 煙酸(A)、洛伐他汀(B)、辛伐他汀(C)的檢出限

2.5 精密度試驗

取2.3項下的混合對照品溶液（煙酸：50 ng/mL；辛伐他汀、洛伐他汀：10 ng/mL），連續進樣6次，計算3種化合物峰面積的RSD分別為：煙酸：1.91%；辛伐他?。?.23%；洛伐他?。?.70%，結果表明儀器精密度良好。

2.6 加樣回收率

分別精密吸取混合對照品儲備液8，10，12 mL各3份，共9份，分別置于50 mL量瓶中，每個量瓶精密加入經測定不含違法添加藥物的保健品試樣處理液20 mL，按“1.6樣品制備”方法處理后進樣分析，將結果代入回歸方程，計算回收率，3種化學成分的平均加樣回收率分別為：煙酸96.9%，辛伐他汀98.8%，洛伐他汀95.4%。

2.7 樣品測定結果

按1.6項下對20批降血脂類保健食品進行樣品前處理，以所建液質聯用方法對樣品進行定性、定量分析，其中2批供試品的子離子掃描圖與煙酸對照品的特征離子對（m/z 124→106和m/z 124→80）一致，通過MRM質譜圖計算煙酸含量分別為89.2 μg/g和125.4 μg/g，其余批次樣品均未檢出煙酸、辛伐他汀和洛伐他汀。此外，運用國家食品藥品監督管理總局頒布的標準方法對上述批次樣品檢測[3]，其陽性檢出結果與本方法一致。

3 討論

高血脂癥作為一種高發的現代病，可引發動脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等一些嚴重危害人體健康的疾病。除了降血脂藥物，以調節血脂為功效的保健食品的國內市場銷量不斷上升。然而，一些生產商受利益驅動，在該類保健品中人為摻雜化學藥物，嚴重威脅了服用者的生命健康[4-5]。如長期過量服用煙酸可導致心律失常、肝功能損傷[6]；而他汀類藥物除一般的消化系統反應外，還能誘發橫紋肌溶解癥，重者可導致急性腎衰[7-8]。由于這些違禁藥物具有添加量少，隱蔽性強等特點，開發靈敏度高、專屬性強的快速定性、定量分析方法已成為當務之急。

本實驗針對國家食品藥品監督管理總局規定的煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀等3種輔助降血脂類保健品違法添加藥物，基于UPLC的超高分辨能力、超高分析速度，及MS/MS提供的結構信息，開發了同時定性、定量檢測上述3種非法添加藥物的分析方法。通過子離子掃描和MRM掃描模式，針對每個化合物選取兩個特征碎片離子作為定性依據，同時選擇其中響應較高的反應離子對作為定量離子對，從而實現定性定量同時分析。并將該方法應用于20批降血脂類保健品非法添加的檢測，檢驗結果與國家食品藥品監督管理總局頒布的標準方法一致，但本方法大大縮短了分析所需時間，并同時計算出違法添加藥物的含量，改進了現行的標準檢驗方法，提高了降血脂類保健食品非法添加的檢驗效率，為該類保健食品的安全監控提供了可靠的技術保障。

[1]白鴻.保健食品功效成分檢測方法[M].北京：中國中醫藥出版社，2011：66.

[2]謝志潔.健康產品中非法添加化學成分快速篩查方法理論與實踐[M].廣東：華南理工大學出版社，2011：10-16.

[3]國家食品藥品監督管理局.輔助降血脂類保健食品違法添加藥物的檢測方法[S].國食藥監辦許[2010]114號.2010-04-27.

[4]李丹，文紅梅，崔福春，等.LC-MS/MS法快速測定中成藥、保健食品中非法添加的36種化學成分[J].藥物分析雜志，2010，30（8）：135-140.

[5]陳海濱，吳春敏，胡敏，等.LC-MS/MS檢測降壓類中藥制劑中非法添加的9種化學藥物[J].海峽藥學，2012，24（9）：51-54.

[6]Kirkland JB.Niacin requirements for genomic stability[J].Mutat Res，2012，733（1-2）：14-20.

[7]Toth PP.An update on the benefits and risks of rosuvastatin therapy[J].Postqrad Med，2014，126（2）：7-17.

[8]Robinson M，Gunning K，Pippitt K，et al.Team-based approach to addressing simvastatin safety concerns[J].J Am Pharm Assoc，2013，53（5）：539-544.

Rapid Identification of Illegal Additives in Lipid Lowering Health Foods by UPLC-MS/MS

Hao Gang，Gu Bingren（Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215104，China）

Objective：To develop a specific and sensitive method by UPLC-MS/MS for the qualitative and quantitative detection of 3 illegal additives in lipid lowering health foods.Methods：UPLC-MS/MS was adopted to test the samples extracted with methanol.BEH-C18was used as the analytical column with 20 mmol/L ammonium acetate aqueous solution and methanol as the mobile phase for isocratic elution.The qualitative and quantitative detections of 3 chemical components including nicotinic acid，simvastatin and lovastatin were conducted UPLC-MS/MS in the mode of electrospray ionization (ESI)，the daughter ion scan and multiple reaction monitoring（MRM）.Results：The established method can identify within 1 min the 3 illegal additives in health foods qualitatively and quantitatively.The calibration curves showed a good linear relationship for each component.The determination limit was at 0.5～12.5 μg/g，and the average recovery rate was 95.4%～98.8%.Conclusion：The method was proved to be specific，rapid and sensitive，which can be used to identify 3 illegal additives in lipid lowering health foods.

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.07.005

2014-06-27）

蘇州市科技發展計劃項目科技支撐計劃（SS201220）

郝剛，男，博士，主管藥師。研究方向：食品藥品質量安全監控。E-mail:haogang531@163.com

顧炳仁，男，主任藥師。研究方向：食品藥品質量安全監控。通訊作者E-mail:gubingren@163.com