靈芝三萜酸組分高效液相色譜指紋圖譜初探

魏曉霞 李鵬 孫紅 莊捷

（1福建省立醫院藥學部，福建福州 350001；2福建醫科大學藥學院天然藥物學系，350004）

靈芝三萜酸組分高效液相色譜指紋圖譜初探

魏曉霞1李鵬2孫紅1莊捷1

（1福建省立醫院藥學部，福建福州 350001；2福建醫科大學藥學院天然藥物學系，350004）

目的：建立靈芝三萜酸組分（GLA）的指紋圖譜，為其質量控制提供依據。方法：使用植物組織破碎法提取GLA，利用高效液相色譜法建立GLA的指紋圖譜。結果：GLA高效液相色譜指紋圖譜中有8個峰為其主要特征，其α值分別為0.68，0.73，0.90，0.95，1.00，1.12，1.36，1.46。結論：所建立的RP-HPLC指紋圖譜分析方法可為GLA的質量控制提供理論依據。

靈芝三萜酸；指紋圖譜；高效液相色譜法

靈芝(Ganoderma lucidum[Leys.ex Fr.]Karst）為多孔菌科（polyproraceae）、靈芝屬（Ganoderma）真菌植物赤芝（Ganoderma lucidum[Leys.ex Fr.] Karst）或紫芝（Ganoderma japonicum[Fr.]Lloyd）的干燥子實體[1]。靈芝性溫、味甘，多分布于閩、貴、云、冀、蘇、吉、浙等省，在我國已有悠久的藥用歷史，始載于《神農本草經》，具有補中益氣、扶正固本、滋補強壯之功效，是一種珍貴的中藥材[2]。三萜類化合物是靈芝主要成分之一。其中靈芝三萜酸組分（GLA）是靈芝三萜中的一大類成分，具有多種藥理活性，前期研究發現其具有一定抗腫瘤[3]和保肝作用[4]，本實驗利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）技術，建立GLA的高效液相色譜指紋圖譜，為GLA的質量控制提供實驗依據。

1 儀器與藥品

1.1 藥材

靈芝子實體精粉，3批次（批號GC-L3-20120821、GC-L3-20120922、GC-L3-20121010），由福建仙芝樓生物科技有限公司提供。

1.2 試劑

乙腈、甲醇為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、冰乙酸均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；碳酸氫鈉為化學純（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 儀器

AB204-E電子分析天平（Mettler Toledo公司）；JHBE-50型閃式提取器（北京金鼐科技發展有限公司）；HH-4型數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；RE-52A旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配二極管陣列檢測器，自動進樣器；處理軟件（Agilent化學工作站）。

2 方法

2.1 供試品制備

將靈芝子實體精粉經無水乙醇閃式提取、抽濾與減壓蒸餾后，無水乙醇提取浸膏拌硅藻土后，以石油醚索氏提取除雜后再用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取液用飽和NaHCO3溶液萃取，NaHCO3層酸化后再用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮真空干燥即得GLA[5]。共制備3批次來源于靈芝子實體精粉的GLA樣品備用。參照《中華人民共和國藥典》RP-HPLC的有關規定[6]，精確稱取GLA樣品，用乙腈配成10 mg/mL供試品，0.45 μm微孔濾膜過濾，RP-HPLC進樣量5 μL。

2.2 色譜條件

依利特C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；填料Hypersil ODS 25 μm（柱號E1720569)；流動相甲醇-水（含2%乙酸），梯度洗脫條件見表1；檢測波長252 nm；進樣量5 μL；流速0.8 mL/min；柱溫35℃。

表1 線性梯度洗脫條件（體積百分比%）

2.3 HPLC分析

取3批次供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，自動積分記錄色譜圖（圖1、圖2、圖3）和各色譜峰的保留時間，以面積歸一化法計算各色譜峰的相對峰面積。

圖1 GLA的RP-HPLC圖（批次GC-L3-20120821）

圖2 GLA的RP-HPLC圖(批次：GC-L3-20120922)

圖3 GLA的RP-HPLC圖(批次：GC-L3-20121010)

2.4 相對保留值指紋圖譜的確定

選擇一個保留時間居中且在各樣品中均存在的色譜峰作為參照物，指定它的相對保留時間（relative retention time）α=1，并分別求出樣品中各組分的相對保留值為：

式中tR（i）為各組分的出峰時間，tR（s）為參照峰的出峰時間。

以某一樣品的色譜峰總面積為分母，各樣品中每個色譜峰面積為分子，求得該色譜峰的相對峰面積（ratio of peak area，RA），將它標在其α值項下，最后將各樣品的α按由小到大的次序依次排列成行。每個樣品色譜峰的相對保留值α和相對峰面積RA構成了其HPLC的指紋特征。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗取同一GLA樣品，按2.1制備供試品，連續進樣5次，考察主要色譜峰的α和RA的一致性。相對標準偏差(RSD)是試驗可信度的一種考察標準，根據檢測數據，計算各自的RSD。

2.5.2 穩定性試驗取同一GLA樣品，按2.1制備供試品，分別在0 h，4 h，8 h，12 h和16 h檢測指紋圖譜，考察主要色譜峰的α和RA的一致性，并計算各自的RSD。

2.5.3 重現性試驗取同一批號GLA樣品5份，按2.1制備供試品，考察主要色譜峰的α和RA的一致性，并計算各自的RSD。

3 結果

3.1 GLA色譜圖

按2.3進行HPLC分析，得到3批次GLA高效液相色譜圖，見圖1、圖2、圖3。

3.2 指紋峰的標定

采用α標定指紋峰，以5號色譜峰作為參照峰，計算各待測峰的α及RA。結果見表2，表3。3批次GLA供試品中含量較高的峰集中在0.90～1.11區域，α值為0.90（峰3），0.95（峰4），1.00（峰5），1.12（峰6）處有4個較強峰；0.68（峰1），0.73（峰2），1.36（峰7），1.46（峰8）處有4個中等強峰。這8個色譜峰的RA均占總峰面積的3.3%以上，說明這8個峰的含量較高，可能是GLA組分中的主要成分。

表2 GLA指紋圖譜共有峰相對保留時間（α）

表3 GLA指紋圖譜共有峰相對峰面積（RA）

3.3 儀器精密度

分別取同一供試品溶液5 μL，連續進樣5次，色譜峰均自動積分。比較不同色譜圖中主要色譜峰的α和RA。結果表明，所標定色譜峰的α和RA基本一致，RSD均小于3%，符合指紋圖譜的檢測要求[7]。說明儀器系統精密度良好。見表4。

表4 GLA的精密度實驗數據

3.4 穩定性試驗

分別取同一供試品溶液5 μL，每隔4 h進樣一次，16 h內連續進樣5次，色譜峰均自動積分。比較不同色譜圖中主要色譜峰的α和RA。結果表明，所標定色譜峰的α和RA基本一致，RSD均小于3%，符合指紋圖譜的檢測要求[6]。說明GLA樣品性能比較穩定。見表5。

3.5 重現性試驗

取同一批號靈芝子實體精粉，按2.1項下方法制備5份供試品溶液。每份樣品進樣5 μL，色譜峰均自動積分。結果表明，所標定色譜峰的α和RA基本一致，RSD均小于3%，符合指紋圖譜的檢測要求。所考察的共有色譜峰的重現性良好。見表6。

表5 穩定性實驗數據

表6 GLA重現性實驗數據

4 討論

中藥的藥效是所含有的多種化學成分通過多靶點、多環節發揮綜合作用的結果，GLA的藥效是多種靈芝三萜酸類成分共同起作用的結果。僅分析測定一種或某幾種靈芝三萜酸來評價其質量是不全面的，本文建立的GLA高效液相色譜指紋圖譜是GLA中三萜酸類成分整體的綜合表達，更能全面評價GLA的質量。因此，GLA的RP-HPLC指紋圖譜是控制GLA質量的有效手段，具有一定必要性和先進性。本文所建立的方法得到的色譜指紋圖譜多數峰未達到基線分離，因此不適用于GLA的定量控制，但可以作為GLA質量控制中的定性控制方法。通過測定一種或某幾種靈芝三萜酸來作為GLA質量的定量控制方法，再結合本文建立的GLA質量的定性控制方法，可以全面控制GLA質量。3批次GLA樣品的指紋圖譜，各主要色譜峰的α分別為0.68，0.73，0.90，0.95，1.00，1.12，1.36，1.46。這8個色譜峰為3批次供試品的共有指紋峰，是鑒別GLA樣品的必要條件之一。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：174.

[2]江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海：上海科學技術出版社，1985：1180-1182.

[3]魏曉霞，李鵬，許建華，等.靈芝三萜組分GLA體內外抗腫瘤作用的研究[J].福建醫科大學學報，2010，44（6）：417-418.

[4]李鵬，魏曉霞，南婷婷，等.靈芝三萜酸對小鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國醫院藥學雜志，2013，33（23）：4-8.

[5]徐任生，陳仲良.中草藥有效成分提取與分離[M].2版.上海科學技術出版社：218-223.

[6]潘君漢.淺談中藥指紋圖譜的意義[J].中國藥業，2008，17（6）：13-14.

[7]國家食品藥品監督管理局.關于印發《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》的通知[J].中國藥品標準，2000，1（4）：3.

Preliminary Study on HPLC Fingerprint of Triterpene acids Components from Ganoderma Lucidum

Wei Xiaoxia1，Li Peng2，Sun Hong1，Zhuang Jie1（1 Pharmacy Department of Fujian Provincial Hospital，Fujian Fuzhou 350001，China;2 Department of Natural Medicines of Pharmaceutical College of Medical University，350004）

Objective:To set up the fingerprint of triterpene acids components of ganoderma lucidum（GLA）and to provide a basis for its quality control. Methods:To extract the triterpene acids components of ganoderma lucidum by plant tissue crushing method and to establish the fingerprint of GLA by HPLC.Results:There were 8 characteristic peaks in HPLC fingerprint of GLA，their alpha values were 0.68，0.73，0.90，0.95，1.00，1.12，1.36 and 1.46 respectively.Conclusion: The established RP-HPLC fingerprint can provide a theoretical basis for the quality control of GLA.

Ganoderma lucidum；Triterpene acids；Fingerprint；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.04.006

2014-02-08）

國家自然科學青年基金（81202560）；福建省教育廳科技計劃項目（JA11107）；2011年福建省高校產學合作科技重大項目（2011Y4003）

魏曉霞，女，碩士。研究方向：腫瘤藥理。通訊作者E-mail：xxwei0321@163.com