高效液相色譜法測定人血清中伏立康唑的質量濃度

張燕青，林雪玉，朱金平，費 燕

（中國人民解放軍第一七五醫院·廈門大學附屬東南醫院藥學科，福建 漳州 363000）

伏立康唑（voriconazole，VRC）是第2代三唑類抗真菌藥物，具有抗真菌譜廣、生物利用度高、安全且可通過血腦屏障等特點，在真菌感染防治中發揮著重要作用。臨床研究發現，伏立康唑的有效性和安全性與其血清質量濃度密切相關[1－3]，有效質量濃度范圍為 2 ～5μg/mL[3]，大于 6 μg/mL 時肝臟毒性的發生風險顯著增加[4]。伏立康唑體內代謝呈非線性藥物代謝動力學特征，血藥濃度在不同患者間差異較大，臨床可通過監測其血藥濃度來提高臨床療效、減少不良反應的發生。筆者采用高效液相色譜(HPLC)法測定人血清中伏立康唑濃度，方法簡單可靠、相關性好，可用于伏立康唑的血藥濃度常規檢測。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(美國 Waters公司)，包括510泵，717自動進樣器，996二極管陣列檢測器；Milli－Q純水器(美國Millipore公司)；XW－80A型旋渦混合器(上海醫科大學儀器廠)；電子分析天平(日本島津AEG－120型)；TGL－16M型臺式高速冷凍離心機(長沙英泰儀器有限公司)。伏立康唑對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為100862－200701)；內標為硝西泮對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為 171217－200402)；乙腈、甲醇(Tedia公司，色譜純)，其他試劑均為分析純，水均為雙蒸水（本實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 血清來源

采集健康體檢者的靜脈血，低速離心后，取上層血清制備空白血清，備用。采集診斷為侵襲性真菌感染，并使用伏立康唑進行治療且達到穩態濃度的患者下次滴注伏立康唑前的靜脈血，低速離心后，取上層血清備用，作為患者血清樣品。

2.2 血藥濃度測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS 柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：25 mmol/L 磷酸二氫鉀緩沖液 －乙腈（32 ∶68）；流速：1.0 mL /min；柱溫：35 ℃；檢測波長：256 nm；進樣量：50 μL。

2.2.2 溶液配制

精密稱取伏立康唑對照品30 mg，置25 mL的容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，配成質量濃度1 200 μg/mL的對照品貯備液，4℃冰箱中保存備用。精密稱取25 mg硝西泮對照品，置25 mL的容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，配成濃度1 000 μg/mL的對照品貯備液，將該貯備液用甲醇稀釋成25 μg/mL工作液，作為內標液，4℃冰箱中保存備用。

2.2.3 血清樣品處理

精密取血清樣品 200 μL于 1.5 mL Eppendorf管中，加入10 μL內標溶液，混勻后，加入乙腈 400 μL漩渦振蕩 2 min，13 000 r/min離心 10 min，取上清液 200 μL進樣分析。

2.2.4 方法學考察

標準曲線制備與檢測限確定：取空白血清200 μL，置1.5 mL Eppendorf管中，精密量取不同質量濃度、相同體積的伏立康唑對照品溶液 10 μL，配成 0.3，0.6，1.0，1.5，3.0，6.0，12.0 μg/mL標準血清樣品，再分別加入 10 μL內標液，按2.2.3項下方法處理，經HPLC分析，記錄色譜圖，測得伏立康唑峰面積A1與內標峰面積 A2，計算峰面積比 A1/A2。以血清質量濃度 C(mg/L)與峰面積比經最小二乘法線性回歸，得標準曲線方程 Y＝0.377 X－0.063 5，r＝ 0.999 3(n ＝7)。結果表明，伏立康唑質量濃度線性范圍為 0.3～12 μg/mL。當信噪比(S/N)＝3 時，伏立康唑的最低檢測限可達到 0.3 μg/mL。

分離度與專屬性試驗：按擬訂色譜條件對空白血清、伏立康唑標準品血清以及患者血清樣品進行色譜分析，色譜圖見圖1。可見，伏立康唑與內標峰無明顯的內生雜質峰干擾，兩者的保留時間分別為 10.5 min 和 13.3 min。

圖1 伏立康唑高效液相色譜圖

準確度試驗：取空白血清 200 μL，置 1.5 mL Eppendorf管中，配制成質量濃度為 0.6，3.0，6.0 μg/mL 的血漿樣品各5份，按2.2.3項下方法處理，進樣，記錄色譜圖，考察方法回收率。結果見表1。

表1 伏立康唑的方法回收率試驗結果(n＝5)

精密度試驗：取空白血清 200 μL，置 1.5 mL Eppendorf管中，配制成質量濃度為 0.6，3.0，6.0 μg/mL 的血漿樣品各5份，按

2.2.3 項下方法處理，進樣，記錄色譜圖，連續 4 d，測定日內和日間精密度。結果見表2。

表2 伏立康唑的日內、日間精密度試驗結果(n＝5)

穩定性試驗:取空白血清 200 μL配制成質量濃度為 0.6，3.0，6.0 μg/mL 的血清樣品各 3 份，室溫放置，分別于第 0，6，12 h按 2.2.3項下方法處理，進樣。結果的 RSD分別為 6.06%，4.21%，4.68%，說明血清樣品在室溫放置12 h內具有很好的穩定性。配制質量濃度為 0.6，3.0，6.0 μg/mL 的血清樣品，置－20 ℃冰箱中，于第 1，3，5，7，10，14 d，按 2.2.3 項下方法處理，測定。結果表明，血清樣品14 d內穩定性良好。配制質量濃度為0.6，3.0，6.0 μg/mL的血清樣品各 3份，置 －20℃冰箱中，凍融 2次，凍融時間間隔 24 h，于凍融前、凍融后分別取樣 200 μL，按 2.2.3項下方法處理。結果顯示，凍融2次，質量濃度無顯著性差異。

2.3 臨床應用

采用本研究建立的方法為10例患者進行血藥濃度監測，其中侵襲性肺部曲霉菌感染8例，骨髓炎（霉菌感染）2例；男7例，女 3 例；平均（42.8 ± 3.6）歲。測定的最大血藥濃度達 5.5 μg/mL，最小為 0.98 μg/mL，平均值為 2.72 μg/mL；其中在治療窗之內4例，占 40.00%；低于治療窗5例，占50.00%;高于治療窗 1例，占 10.00% 。

3 討論

色譜條件的選擇:采用二極管陣列檢測器波長梯度方法，得到三維色譜光譜圖。三維立體圖顯示，伏立康唑在256 nm波長處有最大吸收。以256 nm進行樣本檢測，出峰良好，出峰處無干擾，因而選擇256 nm作為檢測波長。試驗過程中，試用文獻[5－6]報道的氟康唑和酮康唑作為內標，發現在本實驗室條件下，其保留時間在3 min內，不適宜作為內標。選用硝西泮作為內標，性質穩定，不干擾主峰，且保留時間合適；伏立康唑和硝西泮的保留時間分別為10.5 min和 13.3 min，且色譜峰不受內源性雜質干擾。由于伏立康唑的分子結構中含有三唑環、吡啶環等堿性基團，因此采用磷酸鹽緩沖液作為流動相，保持流動相pH穩定，故選用磷酸鹽緩沖液/乙腈為流動相。

樣品處理方法的選擇：血清樣品的前處理一般采用固相萃取、液液萃取、高氯酸和三氟乙酸沉淀蛋白等方法，但考慮到固相萃取、液液萃取方法操作較復雜煩瑣，高氯酸和三氟乙酸可能會對伏立康唑和內標造成氧化破壞，故采用2倍乙腈直接沉淀蛋白，蛋白沉淀較完全。

監測結果分析：臨床伏立康唑常用于治療和預防侵襲性真菌感染，常見的不良反應有神經功能障礙、視覺障礙、肝功能異常等[7－8]。文獻報道，當伏立康唑血藥濃度大于 6 μg/mL 時，肝功能損傷的發生率將明顯增加，不良反應發生率升高，而低于2 μg/mL時，治療效果不佳。伏立康唑主要通過肝臟細胞色素P450酶2C19代謝。CYP2C19基因是一個高度變異的多態基因，具有顯著種族差異，在亞洲人群中造成慢代謝表型最主要的突變基因為CYP2C19＊2和 CYP2C19＊3。研究發現，CYP2C19慢代謝型組伏立康唑的穩態血藥濃度是快代謝型組的5倍。本試驗監測的10例患者伏立康唑谷濃度個體差異大，1例谷濃度高于治療窗，5例谷濃度低于 2 μg/mL，4 例谷濃度在治療窗 2 ～5μg/mL 之內。本試驗中建立的檢測人血清中伏立康唑質量濃度的高效液相色譜法靈敏、簡單、專屬性高，分離完全，峰形良好，可用于伏立康唑的藥代動力學和血清藥物濃度監測。

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