結(jié)腸腺瘤性息肉病基因蛋白在二甲肼誘導大鼠大腸癌過程中的表達*

馬曉強，王偉杰，李 海

（寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院結(jié)直腸外科，寧夏 銀川 750004）

結(jié)腸腺瘤性息肉病基因（APC）是一種抑癌基因，能調(diào)節(jié)細胞 生長和自身穩(wěn)定[1]。目前，許多研究已經(jīng)證實，Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑失調(diào)是人類大腸癌的發(fā)生中的早期事件，其中APC蛋白在Wnt信號通路中起關(guān)鍵的抑制作用。可以說，APC蛋白是一個分子“守門人”，尤其在腺瘤發(fā)生發(fā)展進程中。由于基因產(chǎn)物的改變，往往始于APC的突變，且相應(yīng)的突變在惡性腫瘤中穩(wěn)定存在，從而造成腫瘤的發(fā)生和細胞的無序分裂[2]。因此，通過動態(tài)觀察APC蛋白，了解其表達情況，能加深對APC蛋白及其與大腸癌演變過程之間相互關(guān)系的認識，從而實現(xiàn)大腸癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療，具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 動物與試藥

SD大鼠60只，雄性，6～8周齡，體重200～250 g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證編號為SCXK＜寧＞2005－0001。普通飼料(北京科澳飼料公司)。二甲肼（DMH，日本東京化成工業(yè)株式會社）。

1.2 方法

動物模型的建立和分組：將60只SD大鼠隨機分為模型組40只，正常對照組（C組）20只。兩組大鼠采用標準同型普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，光照時間為12 h，室溫25℃，相對濕度50%環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，每籠 4只。將二甲肼（DMH）溶于 0.001 mol/L的 EDTA溶液，配成 8 g/L的 DMH溶液，備用。模型組大鼠皮下注射 DMH溶液，每周1次（20 mg/kg）；對照組皮下注射與模型組DMH等體積的生理鹽水，每周1次，兩組同時維持給藥25周。分別于第 15周和25周[即大腸腺瘤組（A組）和大腸癌組（B組）]時處死大鼠，兩組各20只，收集大腸組織標本。將其中的一部分大腸組織標本放入－80℃冰箱中，擬行免疫蛋白印跡檢測；將剩下的大腸組織標本以甲醛固定，石蠟包埋，進行免疫組化染色。

1.2.1 免疫組織化學檢測

將大鼠大腸癌組織石蠟切片、脫蠟和水化后，以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗 3次（每次 2～3 min），對組織抗原進行相應(yīng)的修復。每張切片加3%過氧化氫50 μL阻斷，溶液室溫放置10 min，再用 PBS沖洗 3次（每次 2～3 min），移去 PBS液。滴加濃度為1∶100的兔抗鼠APC多克隆抗體，4℃條件下放置過夜。然后以 PBS沖洗 3次，每次3 min，移去 PBS液。在滴加聚合物輔助劑后室溫下孵育 20 min，用 PBS沖洗 3次，每次 3 min。移去PBS液，滴加辣根酶標記山羊抗兔/大鼠IgG多聚體，室溫下孵育 30 min，PBS沖洗 3次，每次 3 min。除去 PBS，每張切片加 2滴新鮮配制的 3，3－四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺（DAB）液，顯微鏡下觀察 3～10 min。自來水沖洗，蘇木素復染，PBS沖洗返藍。DAB顯色，梯度酒精脫水，中性樹膠封固。免疫組化染色結(jié)果判定標準見表 1。兩項計分相乘之積在 0～5分之間記為“－”，5～12分記為“＋”。

表1 APC免疫組化染色判定標準

免疫蛋白印跡技術(shù)檢測：將去除脂肪組織和結(jié)締組織等非目的組織的固體組織樣本剪碎，勻漿，加入含有苯甲基磺酰氯（PMSF）的 RIPA裂解液500 μL裂解組織，提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。制備10%分離膠和5%濃縮膠，每孔上樣50 μg進行 SDS－PAGE電泳。其中濃縮膠條件為80V 45 min，分離膠 110V 90 min；350 mA恒流電轉(zhuǎn) 130 min至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液4℃封閉過夜。分別加入兔抗大鼠 APC抗體（濃度為1∶200）、兔抗大鼠 β－actin抗體（1∶1 000）室溫孵育 2 h。TBST洗膜 3次，加入 HRP標記的山羊抗兔 IgG抗體(濃度1∶1 000)和HRP標記的山羊抗小鼠 IgG多抗(濃度 1∶1 000)室溫孵育 1 h。TBST洗膜 3次，加入 ECL化學發(fā)光試劑自顯影、曝光。用凝膠分析軟件對圖像進行分析。APC蛋白的相對表達量用APC蛋白灰度值/β－actin蛋白灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件。經(jīng)凝膠分析軟件所得的相對強度以±s表示，組間均數(shù)比較采用 t檢驗。組間率的比較采用 χ2檢驗或四格表資料的Fisher確切概率法。假設(shè)檢驗的顯著性水準取 α ＝ 0.05。

2 結(jié)果

2.1 動物建模結(jié)果觀察

大鼠大腸組織HE染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，C組大鼠大腸組織無異常變化，組織彈性好，與周圍組織無黏連，腸腔少量正常糞粒。A組大鼠大腸組織可見數(shù)量不等的絨毛狀成分，同時表現(xiàn)為程度不一的上皮異型性增生，一般輕至中度。B組大鼠大腸組織根據(jù)來源和分化程度的不同在組織學上表現(xiàn)較為多樣，其中乳突狀腺癌表現(xiàn)為粗細不等的乳突狀結(jié)構(gòu)，乳頭細長，癌細胞呈柱狀，可具有不同的分化程度；管狀腺癌由腺管狀結(jié)構(gòu)組成；黏液腺癌則以大量黏液為特征或為囊腺癌結(jié)構(gòu)，囊內(nèi)充滿黏液等。

2.2 免疫組織化學法檢測APC蛋白的表達情況

結(jié)果見表2和圖1。APC染色陽性位置主要在大腸細胞的細胞漿中，細胞漿內(nèi)可見棕黃色或黃色顆粒沉積，A組和B組大鼠組織中均未見有陽性表達；C組大腸細胞組織中陰性10例(50.00%)，陽性 10 例(50.00%)。組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。充分說明APC蛋白在正常大鼠大腸組織中的陽性表達率明顯高于在大腸腺瘤、大腸癌組織的陽性表達率。

表2 APC蛋白在大腸腺瘤、大腸癌與正常組織中的表達

圖1 3組大鼠APC蛋白的表達情況（免疫組化法）

2.3 免疫印跡法檢測APC蛋白的表達情況

結(jié)果見表3和圖2。正常大腸組織經(jīng)Western－blot技術(shù)檢測后，均表現(xiàn)為包含有1條特異性條帶，其相對分子質(zhì)量約為300×103，而該條帶在大腸腺瘤及大腸癌組織卻未曾發(fā)現(xiàn)。利用凝膠分析軟件進行半定量分析，分別得出 IOD值，并跟β－actin比較，顯示APC蛋白的表達在大腸腺瘤、大腸癌與正常組織中差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而在大腸腺瘤與大腸癌組中差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。

表3 APC在大腸腺瘤與正常組織中的相對表達強度（±s）

表3 APC在大腸腺瘤與正常組織中的相對表達強度（±s）

與C組比較組別 I O D值P A組B組C組t值(A組比B組)P(A組比B組)0.0 2 8 ± 0.0 1 1 0.0 9 0 ± 0.3 1 4 0.8 2 3 ± 0.2 1 2－ 2 0.3 8 6 0.0 8 t值－ 1 8.3 8 6－ 1 3.3 8 6 0.0 0 1 0.0 0 0

圖2 3組大鼠APC蛋白的表達情況（免疫印跡法）

3 討論

大腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[3]，世界范圍的流行病學調(diào)查資料表明，在西方發(fā)達國家與癌癥相關(guān)的死亡原因中排第2位，嚴重威脅著人類生命健康。在我國，大腸癌的發(fā)病率呈逐年增高的態(tài)勢，發(fā)病率居第4位[4]。關(guān)于大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，有兩種學說：一是腺瘤－癌序列相關(guān)學說，即所謂傳統(tǒng)概念[5]；一是近年來發(fā)現(xiàn)的新生癌學說，它不經(jīng)過腺瘤性息肉階段，直接由大腸黏膜發(fā)生癌變產(chǎn)生[6]。近年來，雖然在分子生物學水平和蛋白質(zhì)組學方面對其機制的探討取得了較大進展，但對于大腸癌的組織發(fā)生情況一直存在著不同的觀點。鑒于實驗性腫瘤模型在研究癌癥原因、早期治療、疾病預防的重要作用，因此通過建立實驗性大腸癌動物模型，探討大腸癌形態(tài)的動態(tài)變化和進展方式，顯得尤為重要。本研究中對大鼠進行二甲肼皮下注射建立了大腸腺瘤－癌序列動物模型，并觀察了APC蛋白在大腸癌發(fā)病過程中的變化情況，以期發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。

近年來的研究結(jié)果表明，多個抑癌基因的失活和癌基因的激活與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，牽涉到相關(guān)的組織形態(tài)學改變和進行性分子遺傳學改變，其中APC被認為是熱點基因[7]，與大腸腺癌發(fā)生關(guān)系密切。APC蛋白是由Herrera進行細胞遺傳學研究時發(fā)現(xiàn)的一個新的抑癌基因（1986年），在許多組織中幾乎都有表達，它不僅調(diào)節(jié)機體自身穩(wěn)定，還可促進細胞生長[8]。Wnt的信號傳導通路離不開APC蛋白的參與，細胞特化、增殖、極性以及遷移的正常調(diào)節(jié)離不開Axin及Osk－3D與正常組織 APC蛋白的結(jié)合形成復合物[9]。截短的無活性的APC蛋白系A(chǔ)PC基因突變所導致編碼的APC蛋白的改變，野生型APC蛋白產(chǎn)物不能正常地發(fā)揮生理功能，關(guān)鍵是截短APC蛋白與其結(jié)合所產(chǎn)生的一種負顯性作用，能導致細胞癌變的發(fā)生，大到細胞黏附和生長，小到細胞分化、增殖及凋亡調(diào)控和細胞內(nèi)信號等全方位的改變[10]。通過不同組間大鼠大腸組織免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，APC蛋白在正常對照組強陽性表達，而在大腸腺瘤組和大腸癌組中無表達。這表明在大腸癌發(fā)病過程中APC蛋白表達的抑制發(fā)揮了一定的作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)，大腸腺瘤組和大腸癌組大鼠間APC蛋白的表達未見明顯差異，提示在大腸組織不典型增生至腫瘤發(fā)生過程中APC蛋白所起的作用不明顯。這也在一定程度上提示，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中，還有其他因素的參與，這一點在大鼠大腸組織免疫印跡分析中得到了證實。免疫印跡分析結(jié)果顯示，APC蛋白在正常對照組大鼠大腸組織中高表達，而在大腸腺瘤組和大腸癌組大鼠組織中則未見明顯表達。

綜上所述，APC蛋白在大鼠大腸癌的發(fā)病過程中可能起到了啟動作用，在后期疾病惡化過程中可能還有其他的因素參與。APC蛋白可望作為早期預防和檢測的靶點，而更多的大腸癌發(fā)病機制還有待今后進一步深入的研究。

參考文獻：

[1]孫 健，盧 健，鄒冬芳，等.結(jié)腸腺瘤性息肉病基因異常甲基化在上皮性卵巢癌中的檢測及臨床意義[J].東南國防醫(yī)藥，2008(6)：414－417.

[2]陳 玲，葉韻斌，陳燕坪，等.大腸癌組織中核轉(zhuǎn)錄因子－κBp65及磷酸酶和張力蛋白同源缺失基因的表達及意義[J].中國腫瘤臨床與康復，2013(10)：1 057 －1060.

[3]孔 易，鄭紀寧.GST－π和 P－gp在大腸癌中的表達及意義[J].承德醫(yī)學院學報，2013，30(6)：453－455.

[4]王婷婷，陳森清，張曉梅，等.中國人家族性腺瘤性患肉病患者結(jié)腸腺瘤性息肉病基因的胚系突變[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志，2008，25(2)：199－202.

[5]王 成，鄭 多.結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白通過與SMAP/KAP3相互作用與微管結(jié)合[J].生物化學與生物物理進展，2002，29(6)：885－890.

[6]周留林，楊繼實，陳友國，等.β－catenin和APC蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達及意義[J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2008(12)：32－36.

[7]王震凱，劉 炯，汪芳裕，等.β－連環(huán)蛋白和APC蛋白在胃腺瘤和胃癌中的表達及意義[J].胃腸病學和肝病學雜志，2011，20(5)：404－406.

[8]孫 政，曹 杰，梁立源，等.CCN2及APC蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達及意義[J].廣東醫(yī)學，2012，33(11)：1 556 －1 559.

[9]王 偉，滿曉華，湛先保，等.APC蛋白在胰腺癌及其癌前病變中的表達差異分析[J].胃腸病學，2012，17(5)：266 －270.

[10]黃嬋娟，農(nóng)朝贊，顧國龍，等.苦丁茶熊果酸誘導鼻咽癌細胞凋亡及其對 Survivin和 APC蛋白表達的影響[J].廣東醫(yī)學，2011，32(7)：830－832.