反相高效液相色譜法測(cè)定護(hù)肝膠囊中葛根素含量

李曉娟

（安徽省安慶市立醫(yī)院，安徽 安慶 246003）

護(hù)肝膠囊具有疏肝理氣、健脾消食的功效，可降低轉(zhuǎn)氨酶，用 于治療脂肪肝、酒精肝、藥物性肝損傷、慢性肝炎及早期肝硬化等。同時(shí)，具有解酒、調(diào)脂、解毒、抗炎等效果[1]，是臨床用于解酒、保肝臟的一味良藥。其由葛根、金銀花、柴胡、茵陳等6味中藥組方，經(jīng)粉碎過(guò)100目篩后，分裝成膠囊，葛根在方中起到重要作用。本試驗(yàn)中建立了反相高效液相色譜（RP－HPLC）法，并用于測(cè)定護(hù)肝膠囊中葛根素的含量，以控制產(chǎn)品質(zhì)量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

日本島津LC－20AT型高效液相色譜儀，包括SPD－20A檢測(cè)器，CT－20型柱溫箱；上海必能信CQ－80型超聲波清洗器；AB265－S型電子天平（瑞士梅特勒公司）。葛根素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110752－200511）；甲醇為色譜醇，純化水；護(hù)肝膠囊（宜寧藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為 130321，130612，131102，130715，市售品）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：KromasilC18柱（250mm ×4.6mm，5μm，日本島津公司）；流動(dòng)相：水－甲醇（92 ∶8）；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；流速：1.0 mL /min；柱溫：35 ℃ ；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

稱取葛根素對(duì)照品 11.2 mg，精密稱定，干燥 12 h，置 10 mL容量瓶中，加50%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中含葛根素1.12 mg的溶液，作為貯備液；精密量取貯備液1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%的乙醇制成每1 mL約含葛根素0.112 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取護(hù)肝膠囊20粒內(nèi)容物，取內(nèi)容物細(xì)粉約0.1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入50%的乙醇25 mL，50℃超聲處理30 min，放冷至室溫，以50%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，續(xù)濾液經(jīng) 0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液[6－7]。按處方組成比例，稱取除葛根的方中其他藥材適量，與供試品溶液制備方法同法制備溶液，作為陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密吸取 2.2項(xiàng)下 3種溶液各 10 μL，按擬訂的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：精密吸取葛根素對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.112 g /L）1，2，5，10，15，20 μL，分別注入液相色譜儀，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以葛根素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 A＝6.91×105C ＋2.13×105，r＝0.999 7（n＝6）。結(jié)果表明，葛根素進(jìn)樣質(zhì)量濃度在 0.112 ～2.24 g/L范圍內(nèi)與峰面積積分值具有良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一葛根素對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為 0.112 g /L）10 μL，重復(fù)進(jìn)樣 6 次。結(jié)果峰面積積分值分別為5 682 219，5 622 176，5 671 835，5 712 194，5 666 457，5 622 364，RSD ＝0.81%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)的樣品（批號(hào)為130321）5份，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果的 RSD為 0.79%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于制備后 0，2，4，6，8，10 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定 1次，進(jìn)樣量 10 μL。結(jié)果峰面積積分值的RSD＝0.88%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知葛根素含量的樣品（批號(hào)為130321）0.05 g，共 6份，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品貯備溶液 0.5，0.5，1.0，1.0，1.5，1.5 mL，依照 2.2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液并依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 葛根素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

按擬訂的含量測(cè)定方法測(cè)定4批樣品中葛根素的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

中藥制劑中葛根素的含量測(cè)定方法很多[6－7，10，12]，對(duì)該類中藥制劑提取方法的選擇，關(guān)系到藥品主要成分的提取。以葛根素含量為考察指標(biāo)，對(duì)提取溶劑進(jìn)行考察，分別以甲醇、20%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、50%的乙醇溶液25 mL為溶劑超聲30 min，結(jié)果表明，50%乙醇為提取溶劑時(shí)提取的含量較高，故選其為樣品的提取溶劑。同時(shí)，對(duì)樣品提取方式、溫度及時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示回流和超聲提取對(duì)含量的影響不大，且超聲操作較簡(jiǎn)便，時(shí)間以30 min為宜，能將葛根素提取完全，故選用50℃超聲提取30 min作為提取方法。

試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)比不同流動(dòng)相的分離效果，如以不同比例的甲醇－水、乙腈－水、0.05%磷酸溶液－乙腈－甲醇等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明，以流動(dòng)相為水－甲醇（92∶8）時(shí)能將葛根素與雜質(zhì)峰較好地分離，且方中其他成分對(duì)葛根素的含量測(cè)定無(wú)干擾。

生產(chǎn)中，由于中藥制劑的原料可能來(lái)自不同的產(chǎn)地，因此采用不同產(chǎn)地的葛根為原材料進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，根據(jù)測(cè)定的平均結(jié)果，綜合考慮到藥材的產(chǎn)地、采收、加工等因素[8－9，11]，護(hù)肝膠囊每粒含葛根以葛根素（C21H20O9）計(jì)不得少于 3.5 mg。總之，本試驗(yàn)中所建立的含量測(cè)定方法不僅操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，且重復(fù)性好，可用于護(hù)肝膠囊的質(zhì)量控制。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

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