廣東道地藥材何首烏HPLC指紋圖譜研究*

焦豪妍 ，王 英 ，陳麗莉 ，湯慶發

（1.廣東食品藥品職業學院中藥研究所，廣東 廣州 510520； 2.暨南大學中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632； 3.南方醫科大學中醫藥學院，廣東 廣州 510515）

何首烏又稱首烏、赤首烏，為蓼科植物何首烏 Radix Polygonum multiflori的干燥塊根，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便的功效，常用于治療瘰疬瘡癰、風疹瘙癢、久瘧體虛、腸燥便秘等[1]。其化學成分主要有羥基蒽醌類化合物（主要為大黃素、大黃酚、大黃酸等葡萄糖苷），醌類化合物，二苯乙烯苷類化合物，酰胺類化合物，色原酮類化合物，卵磷脂，微量元素鈣、鐵、鋅、錳、銅等[2－7]。藥理學研究表明，何首烏久服能延年不老；能入血分，消痰毒；能止心痛，益血氣；能調氣血、肝風；能專入腎，益精髓；能補肝腎，入肝腎脾經；何首烏功效中之烏發相關的藥理作用研究有待進一步深入[8－14]。何首烏主產于廣東、河南、山東、廣西等多個省區，其中廣東德慶產何首烏種植歷史悠久、品質優，是何首烏的道地品種。本試驗中建立了何首烏藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，對13批樣品進行了相似度評價，并對7個主要成分進行了化學指認，采用SPSS軟件通過聚類分析將樣品聚為Ⅱ類，為何首烏藥材的質量評價和綜合利用提供了科學依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀系統(包括四元泵、真空在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器及Agilent色譜工作站)；KQ3200E型超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司)；Sartorius BP211D型十萬分之一電子分析天平；Jinteng Science溶劑過濾器；四兩裝高速中藥粉碎機(瑞安市永歷制藥機械有限公司)；相似度評價軟件(中國藥典會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件2004A版》)。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為去離子水；何首烏藥材購自德慶市道地產區，產地為德慶市余家巷村，經暨南大學中藥及天然藥物研究所周光雄教授鑒定，為蓼科植物何首烏的干燥塊根。13批次何首烏藥材來源見表1。對照品包括沒食子酸、表兒茶素、2，3，5，4′－四羥基順式二苯乙烯 －2－O －β－D －葡萄糖苷、2，3，5，4′－四羥基反式二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷、決明酮－8－O－β－D－葡萄糖苷、大黃素 －8－O－β－D－葡萄糖苷、大黃素，均由本實驗室分離獲得，采用UV，MS，1H及13C NMR等光譜方法確定其結構。

表1 何首烏藥材來源

2 方法與結果

2.1 溶液制備

精密稱取各對照品適量，置5 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。取何首烏干燥藥材粉碎，過60目篩，精密稱取粉末2.0 g，置100 mL錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 mL，精密稱定質量，超聲提取60 min(250 W，40 kHz)，溫度40℃。放置至室溫后，精密稱定質量，以50%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，經微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得供試品溶液。

2.2 方法學考察

2.2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：XtimateTMC18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A相）－0.1%甲酸水溶液（B相），梯度洗脫程序，B相0～5 min（15% ～15% ），5～30 min（15% ～40% ），30～45 min（40% ～65% ），45～60 min（65% ～100% ）；流速：1.0 mL /min；柱溫：25 ℃ ；檢測波長：270 nm；進樣量：10 μL。所有色譜峰均達到基線分離，且在60 min內完成檢測，理論板數按大黃素峰計算應不低于6 000。

2.2.2 精密度試驗

取2.1項下對照品溶液，連續進樣6次，記錄指紋圖譜。結果相似度均大于0.9，共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明方法儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗

按2.1項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣，記錄指紋圖譜。結果相似度值均大于0.9，共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積 RSD小于3.0%，表明方法重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗

取 2.1 項下供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h 時進樣，檢測指紋圖譜，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版軟件計算相似度。結果均大于0.9，各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積比值無明顯變化，RSD值均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3 相似度計算

運用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)》對13批何首烏藥材的指紋圖譜進行相似度分析，通過中位數矢量計算得出何首烏樣品指紋圖譜的共有模式進行整體相似度評價。

2.4 指紋圖譜分析及評價

共有模式指紋圖譜的建立：取13批何首烏樣品，以2.1項下方法分別制備成供試品溶液，采用擬訂的HPLC色譜條件進行測試，記錄各自的色譜圖(圖1)。將13批何首烏藥材樣品指紋圖譜的AIA數據文件導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A2.0版》軟件進行分析，時間窗0.1，中位數法，以11號峰(大黃素)為參照峰，經多點校正后自動匹配后生成何首烏藥材的對照指紋圖譜，并確定了11個共有峰，何首烏藥材對照指紋圖譜(共有模式)見圖 2。

圖1 13批何首烏藥材樣品的HPLC指紋圖譜

圖2 何首烏藥材對照指紋圖譜(共有模式)

相似度評價：將13批何首烏藥材樣品指紋圖譜的AIA數據文件導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)》軟件，計算各樣品指紋圖譜與生成的對照圖譜 R的相似度。結果見表2?？梢?，除第8批藥材樣品相似度稍差外，其他批次樣品與對照指紋圖譜的相似度在0.924～0.994之間。

表2 何首烏藥材相似度計算結果

相對保留時間和相對峰面積：為更好地說明相似度結果，選擇13批何首烏藥材樣品的指紋圖譜其中5個明顯的共有峰，其保留時間依次為 13.34，17.10，33.75，36.10，47.16 min。以 11 號峰(大黃素)為參照峰，統計相對保留時間和相對峰面積的 RSD。結果顯示，13批供試品指紋圖譜主要共有峰的相對保留時間的RSD均小于 1.0%，但相對峰面積的 RSD差異較大，在 0～96.91%之間，說明各批次何首烏藥材樣品整體具有一定的相似性，但部分色譜峰所代表的化學成分含量有較大差異。

2.5 聚類分析

系統聚類分析是一種無管理、無指導的模式識別方法，根據所測樣品的色譜指紋圖譜特征，對樣品進行分類。應用SPSS 130軟件，采用分層聚類分析方法以歐式距離作為樣本間的相似性測定，采用組間聯結法 (between－groups linkage)測度。聚類分析結果見圖3。當聚合距離為25時，13批樣品大體上聚為Ⅱ類，樣本9，10，11，12，13為第 1類，其余樣本為第 2類。結合色譜圖觀察，此分類情況與樣本來源情況和相似度結果吻合。

圖3 13批樣本聚類分析結果

2.6 主要色譜峰的化學指認

取何首烏藥材樣品(第7批)，按2.1項下方法制備供試品溶液；取本課題組從何首烏中分離得到的7個化學對照品適量，按2.1項下方法制備對照品溶液；以 2.2項下色譜條件分別進行檢測。對比7個對照品的色譜保留行為，何首烏藥材樣品HPLC指紋圖譜中 1，2，4，5，7，8，11 號峰得到了明確的化學指認。結果見圖4。可見，所指認的色譜峰占總峰面積80%，占共有峰面積的90%。

圖4 何首烏HPLC指紋圖譜及7個主要色譜峰對照品的HPLC圖譜疊加圖

3 討論

本研究中在提取、測試條件等方面經過大量試驗摸索，建立了13批不同來源廣東道地藥材何首烏的HPLC指紋圖譜。結果表明，13批何首烏藥材對照圖譜中主要色譜峰的整體圖貌基本一致，與對照圖譜的相似度均較好，但何首烏樣品中主成分的色譜峰峰面積均相差較大，推測是由于采摘季節和生長環境的影響，導致批次樣品的各化學成分含量不一。另外，采用SPSS軟件對13批藥材進行了聚類分析，依據指紋特征，將藥材聚為Ⅱ類。

與以往何首烏指紋圖譜的研究[15－20]不同，本研究中在對何首烏的化學成分進行深入研究的基礎上，前期分離和鑒定了其主要有效成分，除了形成良好的指紋圖譜，還采用課題組分離得到的標準品指認了7個主要有效成分，確定了其化合物結構，所指認的色譜峰占總峰面積80%。該指紋圖譜簡便、穩定、可靠、重復性好，對鑒別藥材的真偽優劣有一定的參考價值。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:164.

[2]李建北，林 茂.何首烏化學成分的研究[J].中草藥，1993，24(3):115.

[3]周立新，林 茂.何首烏乙酸乙酯不溶部分化學成分的研究[J].藥學學報，1994，29(2):107 －110.

[4]陳萬生，楊根金.制首烏中兩個新化合物[J].藥學學報，2000，35(4):273－276.

[5]孫桂波，紀鳳蘭，徐惠波，等.何首烏的化學成分與藥理作用研究進展[J].長春中醫藥大學學報，2007，24(3):105－106.

[6]張志國，呂泰省，姚慶強.何首烏的研究進展[J].解放軍藥學學報，2008，24(1):62 －65.

[7]彭曉波.何首烏的研究與應用[J].中國現代藥物應用，2008，2(19):117.

[8]蘇煥群，陳再智.何首烏藥理研究進展[J].中藥材，1993，16(2):34－37.

[9]顧 慧，呂圭源.何首烏“補肝腎、益精血、強筋骨”功效相關的藥理研究[J].世界科學技術 －中醫藥現代化，2008，10(2):57－63.

[10]管淑玉，蘇薇薇.何首烏的化學成分和藥理作用研究進展[J].中南藥學，2008，6(4):454 －455.

[11]吳曉青.何首烏化學成分與藥理活性的研究進展[J].時珍國醫國藥，2009，20(1):146 －147.

[12]李洪兵.何首烏的現代藥理學研究綜述[J].云南中醫中藥雜志，2012，33(6):72－76.

[13]王文靜，薛詠梅，趙榮華，等.何首烏的化學成分和藥理作用研究進展[J].云南中醫學院學報，2006，30(3):60－64.

[14]孫 芳，馮程程.何首烏的現代藥理作用研究進展[J].科技資訊，2013(33):231.

[15]石 洋，王慧娟，趙 致，等.貴州不同產地何首烏薄層色譜指紋圖譜研究[J].山地農業生物學報，2013，32(1):75－78.

[16]王桂紅，聶 華，胡俊杰，等.何首烏HPLC指紋圖譜研究[J].湖北中醫學院學報，2010，12（2）：29 －32.

[17]房志堅，周洪波，楊立偉，等.何首烏的HPLC指紋圖譜[J].華西藥學雜志，2008，23(5)：513－515.

[18]梁永樞，段 啟，方麗華，等.廣東德慶何首烏藥材HPLC指紋圖譜方法學研究[J].廣東藥學院學報，2006，22(3):265－267.

[19]蔡力行，戈早川.不同產地何首烏指紋圖譜的膠束薄層色譜/紅外光譜研究[J].時珍國醫國藥，2011，22(4):861－862.

[20]高曉霞，嚴寒靜，梁從慶，等.何首烏藥材的薄層色譜指紋圖譜質量評價初步研究[J].中藥材，2007，30（4）：407－409.